Туристическая программа по винодельне

Шато Мухрани с радостью примет в своих просторах одинокого путешественника, влюбленную пару или большую компанию. Винный тур включает в себя ознакомление с историей поместья, рассказ старинных легенд, прогулки по виноградникам, экскурсии по винному производству, дегустация вин и застолье.

Также существуют дополнительная развлекательная программа – приготовление национальных блюд, мастер классы, прогулка верхом на лошадях.

Поездка в Шато Мухрани оставит хорошие воспоминания о путешествии. Это место поражает своей красотой, поместье завораживает могучестью, а люди удивляют гостеприимством и добротой. Отдых в Шато Мухрани пролетит незаметно, а уезжая, захочется вернуться обратно.

Facebook

Twitter

Вконтакте

Одноклассники

Google+

Картофель Шато — Привет, Кухонька! Пошаговые рецепты с фотографиями

6-8 средних размеров картофелин,
сливочное масло,
2 ст. л. оливкового масла,
соль,

Картофель Шато — традиционный гарнир французской кухни. Картофель нарезают «бочонками», бланшируют, и затем обжаривают до золотистого цвета. Этот рецепт взят из книги «On Cooking» (стр. 805).

Ингредиенты:

1. Чистим и моем картофель.

2. Аккуратно, острым ножом вырезаем из картофелины форму «бочонка». Так картошка смотрится намного симпатичнее и из-за маленького размера лучше прожаривается.

3. Вот такие аккуратные бочонки должны получиться из нашей картошки.

4. Далее бланшируем. В кипящую воду опускаем картофелины и варим примерно 5-7 минут (зависит от толщины картошки).

5. Вытаскиваем картофель и даём ему стечь.

6. Далее разогреваем сковороду на среднем огне, наливаем 2 ст. л. оливкового масла, растапливаем в нём сливочное.

7. Выкладываем картошку и на среднем огне обжариваем со всех сторон до уверенного золотистого цвета. Солим и перчим после того, как вынули готовый картофель из сковороды.

8. Всё! Картофель Шато готов. Вообще, он является традиционным гарниром к стейку шатобриан под соусом беарнез. Но думаю, его можно использовать, как гарнир к любому виду мяса. Например, к говяжим мясным шарикам под сливочным соусом.

Bon Appetit!

Другие рецепты:

Шоколадные кексы
187 г муки, 198 г сахара, 28 г какао порошка, 7 г разрыхлителя теста, 3 г соли…

Пирожки с творогом и изюмом
Для теста: 750-800 гр пшеничной муки, 7-10 гр сухих дрожжей (или 25 свежих), 300 …

Доминиканский Карнавал
Ежегодно, 27 февраля, в День Независимости Доминиканской Республики проходит феерическ…

Омлет с грибами
2 яйца, 1 ст. ложка йогурта, 1 гриб (шампиньон), 1 ломтик ветчины, 10 гр сливо…

Chateau De La Maltroye / Шато Де Ла Мальтруа Франция

Перейти в каталог с винами

По бургундским меркам Шато де ля Мальтруа (Chateau de la Maltroye) — молодое хозяйство. Оно было приобретено семьей Корню в 1940 году. Тогда Даниэль Пикар — дед нынешнего владельца Жан-Пьера Корню — вместе с постройками приобрел виноградники, которые составляют примерно 80% от нынешних угодий.

Жан-Пьер Корню, успевший поработать инженером в компании Dassault Aviation, возглавил управление хозяйством после заболевшего отца, бывшего пилота Air France, но посвятившего виноделию 20 лет своей жизни. Благодаря знаниям, трудолюбию и неуемной энергии нынешнего владельца  качество вин хозяйства значительно улучшилось за последние 15 лет. Это богатые мощные вина с заметной нотой дубовой бочки в молодых винах, которые также обладают хорошей кислотностью и обнаруживают тона спелых фруктов.

Доктор мацерации, бортовой виномеханик и проектировщик терруаров Жан-Пьер Корню

Великолепное Шато де ля Мальтруа было построено в XVIII веке на месте сгоревшего ранее замка XV века, от которого остались только красивые сводчатые погреба. Подобными безукоризненными и величественными зданиями в Бургундии могут похвастаться лишь владельцы Louis Jadot и Bouchard Pere e Fils, центральные офисы которых также расположены в старинных замках.

Скрытое высокими железными воротами, шато можно легко не заметить с дороги и проехать мимо. За самим зданием, где в былые времена располагался овощной садик, стройными рядами по направлению к подножию холма растут виноградные лозы. Территория, занятая под лозы, официально разделена на три виноградника категории 1-er Сru: Maltroie, Maltroie Crêtes и – огороженное каменными стенами – Clos de la Maltroye, названное в честь замка. Каждое из названий может фигурировать на этикетках вин, однако, если вино произведено из ассамбляжа винограда с разных участков, то на бутылке будет наименование «Maltroie 1er Cru». Лозы шардоне и пино нуара растут вперемежку, что очень характерно для виноградников коммуны Шассань.

Общая площадь всех виноградников, принадлежащих домену – 15 гектаров, 2 га из которых расположены в Сантене, остальные – в Шассань. Средний возраст лоз 50 лет. В год хозяйство выпускает порядка 70 000 бутылок вина. 40% все территории засажены пино нуаром. С виноградников в коммуне Шассань домен производит 2 бочки Bâtard-Montrachet и 10 разных белых вин категории 1-er Cru: La Dent de Chien и La Romanée (наиболее минеральные), Grand Ruchottes, 0,5 га Maltroie Crêtes (никогда не ассамблируется с Clos de la Maltroye!), два парцела Morgeots с разными клонами шардоне, их тоже никогда не ассамблируют (не столь минеральные, но очень насыщенные и мощные), Macharelle, Chevenottes и Baudine. Кроме этого, Chateau de Maltroye производит коммунальное шассань, региональное бургонь блан и алиготе. Из красных вин в коммуне Шассань домен производит три 1-er Cru (Clos de la Maltroye, Clos St.Jean и Boudriottes), коммунальное и региональное вина. С виноградников в коммуне Сантене производятся вина только категории 1-er Cru: La Comme (белое и красное) и 3 бочки красного Gravières.

Механическая обработка почвы, контроль за урожайностью, ручной сбор и ручная сортировка винограда – все это составляет политику Шато де ля Мальтруа, основанную на качестве. Именно этот подход гарантирует получение поистине великих вин, предназначенных для долгого хранения и благородного старения.

Винификацию и выдержку красные и белые вина проходят в раздельных помещениях и погребах. При производстве вин из пино нуара виноград подвергается полному гребнеотделению, применяется практика холодной мацерации в течение 10-14 дней в емкостях с контролируемой температурой. Процесс брожения занимает 25-30 дней. Выдержка в дубе на осадке 14-18 месяцев с последующей легкой фильтрацией.

Шардоне поступает под пресс не позднее двух часов после сбора урожая. Алкогольная ферментация начинается в терморегулируемых чанах при низкой температуре и заканчивается в дубовых бочках. Малолактическая ферментация производится также в дубовых бочках на осадке, затем производится сутираж и выдержка в дубе 12 месяцев. Перед разливом по бутылкам вино слегка фильтруют.

Chateau Le Grand Vostok. История успеха — PORUSSKI.

В гости к пионерам

Когда в начале 2000-х на склоне Гужевой горы выкорчевывали деревья, чтобы разбить здесь виноградники Grand Cru, Франк Дюссенер, первый винодел Chateau Le Grand Vostok, запретил рубить старый дуб. Сегодня это могучее дерево – символ винодельни. Но это продолжение истории. А как она начиналась – в репортаже Дарьи Бендарской.

«Моя поездка в Chateau Le Grand Vostok состоялась в середине октября. Для меня это была возможность закрыть нынешний сезон туров по винодельням и увидеть виноградники осенью, когда основные работы на них уже закончены. Хоть в винодельческом хозяйстве на отдельных виноградниках уборка урожая еще продолжалась, мы побывали на тех, что уже отдыхали после горячей поры последних нескольких месяцев. По правде сказать, я даже и не предполагала, что вживую виноградники могут быть так красивы. И дело даже не только в багряно-желтых цветах осени, всегда настраивающих на лирический лад, или прозрачном воздухе, в котором уже явственно чувствовалось свежее дыхание осени. А в этой тишине, безлюдности, зачарованности и даже какой-то отстраненности всего окружающего пейзажа, что ощущается особенно сильно, когда вырываешься из городского шума, толкотни и пробок. Определенно, долю сказочности добавлял и лес, и тот самый знаменитый королевский дуб, возвышающийся на склоне Гужевой горы, в центре одного из лучших участков Chateau Le Grand Vostok. Возможно, кто-то из вас уже знает эту историю. Когда в начале 2000-х на этом участке выкорчевывали деревья, чтобы посадить виноградники, Франк Дюссенер, первый винодел Chateau Le Grand Vostok, строго-настрого запретил рубить старый дуб. Сегодня это могучее дерево, чей возраст уже перевалил за двести лет, – главная достопримечательность винодельни, ее символ, украшающий этикетки вин Chateau Le Grand Vostok. Причем, что интересно, изображение на них королевского дуба регулярно обновляется, ведь с каждым годом он становится все мощнее и раскидистее. Но дуб – это продолжение истории. А вот как она начиналась.

Здесь вина делать можно. И нужно!

Идея самого проекта – создания на юге России винодельческого хозяйства полного цикла по образу и подобию французского шато – принадлежала Сирилу Неккеру, топ-менеджеру одной из крупнейших дистрибьюторских компаний. Неккер хорошо разбирался в российском алкогольном рынке, много ездил по стране и знал потенциал здешних терруаров. Он был уверен, что в России можно делать вина мирового уровня, причем значительно дешевле. Эта идея вместе с финансовыми и имиджевыми перспективами проекта и была представлена потенциальным инвесторам в 2002 году. Презентация прошла успешно, и проект был принят к реализации. Началась самая сложная и интересная работа с участием французских экспертов – энологов, почвоведов и климатологов. Они исследовали почву, искали водоносные слои и изучали особенности потенциально перспективных терруаров Краснодарского края, и все это в очень сжатые сроки – в течение двух-трех месяцев. Сказать, что полученные результаты удивили французов, – ничего не сказать. Они были потрясены тем фактом, что, оказывается, на планете еще остались терруары такого высокого потенциала, которые до сих пор не задействованы под виноделие.

Уже в мае 2003 года в Крымском районе, хуторе Садовом, на землях бывшего винсовхоза «Аврора», началось строительство винодельни Chateau Le Grand Vostok. Завод был спроектирован французскими специалистами. Все оборудование, включая прессы, бочки и техническое оснащение лаборатории, было доставлено из Франции и собиралось французскими бригадами уже здесь, в полевых условиях, под открытым небом – крыша завода «зашивалась» уже потом. И в сентябре того же года был собран и первый урожай, и заложена на выдержку первая партия вин.

Завоевать доверие

На тот момент Chateau Le Grand Vostok было единственным российским винодельческим хозяйством, которое стало сотрудничать с зарубежными энологами, заложив тем самым в современном отечественном виноделии новый тренд на многие годы вперед. Потомственный винодел Франк Дюссенер, приняв приглашение инвесторов стать главным энологом предприятия, вместе с ним согласился и на главное условие – проживание в хуторе Садовый. Он приехал сюда в 2003 году вместе с женой Гаэель Брюллон, а по совместительству и коллегой – технологом, почвоведом и агрономом. Не всякий бы русский согласился бы здесь жить и работать, и тогда в Chateau Le Grand Vostok шутили, что привезли к себе крепостного француза. Но сам Дюссенер здешние места захолустьем не считал. Наоборот, рассказывал в своих интервью, что это практически Европа: несколько часов дороги на машине, и ты уже в аэропорту Краснодара. Со временем супруги здесь обжились и даже выучили русский язык.

Франк Дюссенер и Гаэель Брюллон олицетворяли собой французскую экспертизу проекта и главные составляющие его успеха – исключительно ответственный подход к виноделию, высокий профессионализм и личный энтузиазм. Хотя первое время им приходилось трудно – вместе со всем вышеперечисленным они олицетворяли собой и совершенно иной подход к виноделию, суть которого состоит в том, что вино – это продукт местности, и его рождение начинается на виноградниках. На юге России все еще работали по советским стандартам, и идея ограничения урожайности воспринималась бывшими работниками винсовхоза «Аврора» как совершенно вредительская. Доходило вплоть до забастовок. Доверие пришло, когда было сделано первое вино. Вместе с этим пришло и понимание, какое вино на самом деле можно делать – вино, которое благодаря Франку Дюссенеру смогло пробиться в дорогие рестораны страны. Так что новые методы хотя и приживались долго, все-таки утвердились, а доверие еще больше укрепилось, когда вина Chateau Le Grand Vostok стали завоевывать первые медали на международных конкурсах.

Дирижеры одного оркестра

В 2011 году к проекту Chateau Le Grand Vostok присоединился еще один француз – Лоран Дюбрей.

Он стал главным виноделом хозяйства, а Франк Дюссенер сосредоточился на стратегическом развитии проекта. Дюбрей – из плеяды «летучих виноделов», хотя первые три года он тоже жил в хуторе Садовом. Но если Франк Дюссенер в итоге уехал, решив, что уже достиг потолка своего развития в рамках Chateau Le Grand Vostok, то Лоран Дюбрей не выдержал русских реалий. На место Дюбрея приехал Пьер Лампинетти – поклонник органики, биодинамики и нанотехнологий. В Chateau Le Grand Vostok он проработал 2,5 года и в итоге уехал по той же причине, что и Лоран Дюбрей. Но была и еще одна причина: экспрессивный и безусловно очень талантливый, человек-оркестр и винодел-художник, как его называет Ринат Ситдиков, директор по маркетингу ОАО “Аврора”, не нашел понимания среди сотрудников хозяйства. «Они видели, как работали Франк и Лоран – четко, технологично, но они не смогли принять, как можно работать по-другому. Пьер был тоже хорош, но по-своему. Но ассимилироваться он так и не смог. Но как он работал и что он сделал – меня это восхищает до сих пор».

На сегодняшний день главным виноделом Chateau Le Grand Vostok является снова Лоран Дюбрей. Но работает уже он дистанционно: из своего офиса в Бухаресте энолог руководит сразу несколькими винодельческими проектами в странах на постсоветском пространстве, включая Chateau Le Grand Vostok, а также в Турции и Индии. Но Лоран обязательно приезжает, чтобы принять участие во всех ключевых этапах производства Chateau Le Grand Vostok и в дегустациях. Ну а когда он отсутствует, его идеи воплощает второй энолог хозяйства Андраник Манвелян, с которым Лоран Дюбрей познакомился в компании Armenia Wine во время их совместной работы.

Ринат Ситдиков

В поисках истины

С основанием Chateau Le Grand Vostok на землях бывшего винсовхоза «Аврора» на 120 гектарах были высажены новые французские лозы («правильные лозы» – как говорит Ринат Ситдиков) из питомника экстра-класса братьев Мерсье – Каберне Совиньон, Мерло, Совиньон Блан, Шардоне…Черенки сажали тоже по французской технологии: плотность посадки либо 3 тыс., либо 5 тыс. кустов на гектар. В «наследство» от «Авроры» новому хозяйству достались Красностоп и автохтонные сорта Гранатовый и Декабрьский, выведенные Анапской зональной опытной станцией, и Голубок, которым в Chateau Le Grand Vostok очень гордятся. Для самого хозяйства эти виноградники почти тотемные.

 «Как и Саперави, Голубок – это сорт-красильщик и сорт-улучшатель. Его используют в ассамбляжах, чтобы придать вину нужный цвет и правильную ароматику», – поясняет по ходу нашей экскурсии Ринат.

«Вообще французы наши местные сорта очень любят. И именно французы первыми сделали моносепаж Голубка. До этого никто не решался на такой эксперимент. Будучи гибридом, Голубок не очень стабилен сам по себе, и жизненный цикл у него достаточно короткий. Но наши виноделы нашли технологии, как его правильно винифицировать. Первый тираж был сделан в 2009 году, следующие – в 2010 и в 2013 годах».

 «В наших топовых ассамбляжных винах всегда использовался Красностоп. Французы пытаются найти его истинное лицо. Красностоп сейчас очень популярен, все делают на него большие ставки, считают его визитной карточкой современного российского виноделия, но при этом никто еще до конца не понял, как с ним правильно работать. Это очень экспрессивный, даже буйный сорт. Если делать его по классической технологии, то получишь вино инфантильное, капризное, с резкими танинами. Нужно именно угадать время и правильные методы винификации, потому что очень сложно четко определить полифенольную зрелость. Наши французы нашли выход, чтобы придать этому сорту элегантности в бутылке: винифицировать его вместе с Мерло или Каберне. Буквально 5-7 % европейского сорта достаточно, чтобы Красностоп полностью преобразился».

 На участке с королевским дубом лозы сажали в несколько этапов. Это самые лучшие виноградники Chateau Le Grand Vostok – категории Grand Сru. И почвенный состав здесь оптимальный, и экспозиция. Лес защищает от сильных ветров, которые хорошо продувают виноградники, но вреда им не приносят. Главные риски – зимние и весенние заморозки. В апреле, когда почка уже пробудилась, может пойти дождь со снегом. Здесь есть несколько экспериментальных участков с Каберне Фран, Карменером и Сира, но последний сорт, к сожалению, вымерз. Урожайность ограничивается зеленым сбором, но иногда обходятся и без него – если начало лета выдается холодным.

На сегодняшний день общая площадь виноградников Chateau Le Grand Vostok составляет 200 га, из них 130 га – молодые лозы, посаженные в 2003-2009 годах (Каберне Совиньон, Мерло, Совиньон Блан, Шардоне, Алиготе, Пино Нуар, Карменер, Каберне Фран, Пино). Вся территория виноградников поделена на 38 участков, каждый из которых, в свою очередь, разбит на «клетки» по 4 га.

«Комбайном виноград собирается только на равнинных участках – там, где есть возможность технике нормально заехать. Но вообще я считаю, что это садизм по отношению к лозе – она не успевает восстановиться к следующему году. Комбайн очень сильно ее травмирует».

 «В 2015 году я решился на проект – волонтерский сбор винограда. Было четыре смены по десять дней каждая. В каждой бригаде 8-15 человек. После первого дня уборки винограда вручную меня спросили: «А почему ваше вино стоит так дешево?».

Маленький, но гордый

После экскурса на виноградники приезжаем на завод. Ехать всего ничего: хозяйство строилось исключительно по канонам французского виноделия, максимальное расстояние виноградников от винодельни – 8 км.

По сравнению с нашими ветеранами отрасли – той же «Фанагорией» и «Кубань Вино» – завод Chateau Le Grand Vostok выглядит совсем миниатюрным. Но не менее серьезным. Завод построен на склоне, использован гравитационный подход: перепад между цехом приемки винограда и цехом розлива составляет 2,5 метра. Линия для переработки ягод, пневматические прессы, емкости для брожения вин, линия розлива – на предприятии установлено лучшее европейское оборудование из Франции и Италии.

«12 лет назад это были лучшие модели прессов, которые тогда вообще существовали на рынке. И по сей они считаются моделями хай-класса. Прессы отжимают очень деликатно: ягоды давятся о стенки барабана с помощью внутренней мембраны. Кроме того, специально во Франции была заказана емкость, спроектированная по нашему индивидуальному заказу, чтобы площадь контакта сусла с мезгой была максимально большой. Это были первые емкости подобного уровня в России».

Бочки, как и следует ожидать, тоже французские. Хотя поначалу были эксперименты с бочками из кавказского дуба, но в итоге от них отказались, – текли. Пробовали и американские бочки – не подошли. Сейчас основной парк – бочки Vicard. Как объясняет Ринат, «когда ты уже подсел на хорошее, зачем искать что-то еще? Да и наши энологи знают, как работать с французским дубом».

Эксперименты продолжаются, но маленькими тиражами. Например, есть пара бочек венгерского дуба. Основное бочковое хранилище еще не готово принять вина на выдержку, и пока экспериментальная бочковая обустроена прямо в цехе розлива. Вскоре появится и новый цех розлива, и максимальная производительность может составить до 5 тыс. бутылок в час.

«Мы начали стабилизировать вина холодом, оставив наследие «совка» – пастеризацию – в прошлом. Холод позволяет сохранить по максимуму всю ароматику в вине. А вместе с холодом начали использовать и микрофильтрацию».

«Розлив и оформление разбиты на два этапа, чтобы вино в бутылке отдохнуло как минимум два месяца и пришло к оптимальным кондициям. В этом году вина лежат уже порядка 10 месяцев и показывают хорошую, правильную эволюцию».

Живы-здоровы и в отличном настроении

Дегустация – завершающий этап нашей поездки в Chateau Le Grand Vostok. Краткая вводная часть от Рината Ситдикова: «Все наши красные вина выполнены в стилистике вин Бордо. А белые, особенно лучшие наши линейки, можно легко спутать с Бургундией в слепой дегустации. В автохтоны же привносят в эту стилистику свою изюминку». Для нас эта дегустация интересна еще и тем, что практически все вина, представленные на ней, сделаны Пьером Лампинетти.

Белые вина

«Земли Юга». Резервная версия. 2015
Состав: Алиготе, Пино Блан, Пино Гри.
Цвет: золотистый, прозрачный, тонкие «ножки» на стенках бокала.
В аромате: первые ноты – белая смородина, мед, чувствуется сильная спиртуозность.
Во вкусе: та же сильная спиртуозность, очень явная горчинка и перечность. Кажется, что ты глотнул ложку белого перца. Но спустя пару минут остается только тепло и вопрос «что это было?». Еще мгновение – и появляется косточка яблока, банан, завершает которые сладковатое и в то же время освежающее продолжительное послевкусие. Интересно, что вино, которое по началу кажется очень напористым и даже агрессивным, совсем скоро начинает очень нравиться, пусть даже горчинку в нем не назовешь элегантной, а спиртуозность выходит на первый план и в аромате, и во вкусе.

Совиньон Блан 2015

Цвет: чистый, золотистый.
В аромате присутствуют совсем не классические сортовые тона: белый персик, изюм, яблоко, хересные ноты. Сильная спиртуозность. Аромат очень объемный, сладкий, щедрый – очень южный, одним словом, но совсем не Совиньон Блан. Вкус гораздо более сдержанный, суховатый, с явной горчинкой и сладковатым освежающим послевкусием.

Шардоне 2015
Цвет: бледно-золотистый, прозрачный.
Аромат: очень нежный, сочный, изящный, вопреки Совиньону, сразу узнаваемый: в нем и банан, и спелый ананас, и белое яблоко, цветы, затем появляются белые сухофрукты, минеральность.
Вкус: более сдержанный, даже скуповатый, чувствуется явная спиртуозность, перечность, в долгом послевкусии очень выражена косточка яблока.

«Кюве Карсов 2014»
Состав: Шардоне 60%, Совиньон 40%.
Выдержка в дубовой бочке около года, средний обжиг.
Цвет: бледно-золотистый.
Аромат: банан, белые цветы, персик, изюм, зеленый лист.
Вкус: спиртуозность, которую чувствуешь сразу, быстро сменяет ноты меда и ириски, ярко выраженная кислотность, освежающее послевкусие.

 Красные вина

«Земли юга»
Резерв, 2015
Состав: Мерло, Каберне Совиньон, Красностоп, Пино Нуар, Голубок.
Частичная выдержка в дубе около полугода.
Цвет: рубиновый с коричневым ободком.
Аромат: очень свежий, с живыми танинами. Ваниль, черешня, дуб, черная смородина, черные ягоды, кожа.
Вкус: высокая спиртуозность, тона земли, угля, перца, черных ягод, горького шоколада и изюма.
Очень элегантное вино!

Красностоп 2014
В аромате: кожа, чернослив, черные ягоды, немного дыма.
Во вкусе: кожа, шоколад, ягоды, послевкусие суховатое, вяжущее. Постояв в бокале, меняется: становится мягче, выразительнее, появляются шоколадно-ванильные ноты, табак.
В целом тяжеловесное, массивное и в то же время элегантное вино.

Каберне Совиньон 2015
В аромате: карамель, черная смородина, черешня, зеленые листья.
Во вкусе: свежие черные ягоды.
Очень питкое вино! В сравнении с предыдущим образцом – легкое, игривое, изящное. Как мы его назвали – «веселое вино», это Каберне определенно чувствует себя хорошо и пребывает в отличном настроении. Молодое вино без недостатков молодого вина.

«Кюве Карсов» 2014
Состав: Каберне Совиньон, Мерло, Красностоп.
В аромате: шоколадно-сливочные ноты, карамель, ягоды.
Во вкусе: жестковато, суховато, вино еще развивается, тона шоколада, перца, кофе, ванили.

Очень разные вина, в разных «весовых категориях», но каждое по-своему очень интересно! Это вина, которые, на мой взгляд, лучше всего дегустировать в компании: они вызывают эмоции, с ними хочется делиться, обсуждать, дискутировать. Определенно, это нескучные вина, со своим темпераментом и явно южным характером, живые, жизнерадостные и очень неоднозначные в самом лучшем смысле этого слова».

Chateau Talbot (Шато Тальбо) | Винозавр

Посреди настоящего океана лоз на земле Saint-Julien-Beychevelle раскинулось винное хозяйство Chateau Talbot (Шато Тальбо). Свое название поместье получило благодаря Connétable Talbot, правителю французской провинции Гюйен (Guyenne), который был убит в сражении Кастийоне (Castillon) в 1453 году.

Как и многие другие старинные поместья Chateau Talbot неоднократно меняло своих владельцев. То, что оставалось всегда – это высокий разряд, присвоенный хозяйству в 1855 году императором Наполеоном III. В течение следующих нескольких десятилетий поместье принадлежало маркизу d’Aux (д’О). В 1917 году его приобрел Дезире Кордье. Сын Дезире – Жорж, а затем и внук Жан продолжили заниматься в Шато Тальбо виноделием. И именно благодаря их усилиям вина шато стали всемирно известными, а бренд получил статус престижного. Жорж начал производство одного из старейших вин в Медоке – белого сухого вина Caillou Blanc. Ароматное и живое, оно довольно быстро нашло своих поклонников и сейчас остается одним из лучших вин компании.

В 1960-ые было начато производство еще одного известного вина Chateau Talbot — Connetable de Talbot. Отличное сочетание цены и качества делало это вино идеальным для тех, кто хотел прикоснуться к доступной роскоши.

После смерти Жана Кордье в 1993 году бразды правления Chateau Talbot перешли в руки двух его дочерей Lorraine и Nancy (Лорейн и Нэнси). Опыт прошлых поколений, былые успехи и неудачи компании помогли новым управляющим сформировать на винодельне команду, работавшую с тем уважением и с такой любовью, которые заслуживало это место. За 15 лет упорной работы эта команда смогла сделать Шато Тальбо передовой винодельней, полностью подтверждающей высокий статус, данный ей когда-то.

В 1989 году был переоборудован погреб. Главной его особенностью стали деревянные бочки, характерные для прошлых веков. Примерно в это же время второй подвал был оснащен компьютерами, которые контролировали температурный режим, и стальными бочками. Вот так компании удалось сочетать влияние прошлых лет с современными потребностями производства.

Весна 2011 года принесла печальную весть о кончине Лорейн. Семейное дело перешло в руки Нэнси и ее мужа. Именно они сейчас являются продолжателями истории Шато Тальбо. Истории страстной любви к виноделию.

Сейчас основной сорт винограда, выращиваемого в Шато Тальбо, – это Каберне Совиньон. Он составляет примерно 60% от всего здешнего винограда. Помимо него культивируются Мерло, Каберне Фран и Семийон. Естественно, из года в год урожай разнится, но это ни в коем случае не сказывается на качестве и престиже вин Chateau Talbot.

Шуто Происхождение фамилии, значение и история фамилии

Откуда взялась фамилия Шуто?

Фамилия Шуто (грузинский: შუტო, хинди: शुतो, русский: Шуто) встречается в Японии чаще, чем в любой другой стране или территории. Его можно найти как: Shutô. Щелкните здесь, чтобы узнать о возможных вариантах написания этой фамилии.

Насколько часто встречается фамилия Шуто?

Эта фамилия является 85 702 ^и наиболее часто используемой фамилией на земле. Ее владеет примерно 1 из 1 295 103 человека.Фамилия Шуто встречается в основном в Азии, где проживает 97 процентов Шуто; 96 процентов проживают в Восточной Азии и 96 процентов — в Японии. Это также 499 178 ^-е , наиболее часто встречающееся имя на Земле. Его несут 310 человек.

Эта фамилия чаще всего используется в Японии, где ее носят 5 404 человека, или 1 из 23 657. В Японии он в основном встречается в: Метрополисе Токио, где проживают 15 процентов, префектуре Гунма, где проживают 13 процентов, и префектуре Ниигата, где находятся 8 процентов.За пределами Японии эта фамилия встречается в 25 странах. Это также распространено в Соединенных Штатах, где находится 1 процент, и на Украине, где находится 1 процент.

Тенденция численности населения семьи Шуто

Появление Шуто изменилось с годами. В Соединенных Штатах доля населения с фамилией увеличилась на 5 500 процентов в период с 1880 по 2014 год.

Статистика фамилий Шуто

В Соединенных Штатах Шуто 11 лет.Вероятность регистрации в Демократической партии на 06% выше, чем в среднем по США, при этом 64,29% будут зарегистрированы в политической партии.

Сумма, которую Shuto зарабатывает в разных странах, незначительно различается. В Соединенных Штатах они зарабатывают на 18,83% больше, чем в среднем по стране, зарабатывая 51 276 долларов США в год, а в Канаде они зарабатывают на 17,47% больше, чем в среднем по стране, зарабатывая 58 362 канадских доллара в год.

Солдаты обвиняют «Юнити» в том, что он закрыл двери, чтобы женщина не сбежала после боя

Мужчина из «Юнити» обвиняется в том, что он запирал двери в своем доме, чтобы удержать женщину, на которую он якобы напал в Новый год, от отъезда, сообщает полиция штата.

Ирвин Скотт Ахаммер, 27 лет, обвиняется в том, что он столкнул женщину с перил и ударил ее зажигалкой во время ссоры около 15:00. В пятницу в своем доме на шоссе 982 недалеко от Баггали, заявил солдат Николас Мур в судебных документах. Когда женщина пригрозила уйти из-за опасений дальнейшего насилия, она сказала солдатам, что Ахаммер достал дрель, «чтобы закрыть все двери, чтобы жертва не сбежала из дома», — сообщил Мур.

Аххаммер был арестован в субботу по обвинению в преследовании и незаконном ограничении свободы.

Мур сказал, что женщина пошла в казармы полиции штата в Гринсбурге в субботу, чтобы подать заявление, сказав, что ей пришлось подождать, пока Аххаммер заснул, чтобы позвать на помощь и уйти.

В 2017 году полиция штата арестовала Ахаммера по обвинению в домогательствах, простом нападении и удушении за нападение на женщину, согласно протоколам суда. Он признал себя виновным 22 января 2019 года и был приговорен к лишению свободы на срок от 6 до 23 месяцев, как показывают записи. Обвинения в преследовании и удушении были отклонены в рамках соглашения о признании вины.

Судебные записи показывают, что он был условно-досрочно освобожден в сентябре.

В 2014 году Аххаммер отбыл шесть дней в окружной тюрьме за нарушение постановления о защите от злоупотреблений, как показывают судебные протоколы.

Согласно онлайн-протоколам судебных заседаний, он имеет обширный список случаев краж со взломом, мелких нарушений закона о наркотиках и краж, начиная с 2012 года.

Судебные записи показывают, что 18 января у Ахаммера назначено еще одно предварительное слушание перед окружным судьей Юнити Майклом Махади по обвинению в краже, поданному в прошлом году.

По новому делу, Аххаммер содержался в окружной тюрьме под залог в размере 50 000 долларов, согласно онлайн-протоколам суда.

У него не было адвоката, указанного в судебных документах.

Пол Пирс — штатный писатель Tribune-Review. Вы можете связаться с Полом по телефону 724-850-2860, ppeirce@triblive. com или через Twitter.

2020-2021 Регистрационная информация

Начальная школа Нэн Грей Дэвис

Регистрация 2020-2021

ОНЛАЙН РЕГИСТРАЦИЯ

Из-за определенных ограничений COVID- иметь возможность встретиться лично.Чтобы записать вашего студента и получить график на 20-21 учебный год, прошу заполнить процесс регистрации онлайн и отправьте необходимую регистрационную документацию электронная почта или факс.

ВЕБ-САЙТ : mcpss.com

• Отредактируйте онлайн-регистрацию вашего ребенка , используя имя пользователя и пароль, отправленные вам в марте 2020 года. не запечатывает автоматически, следуйте приведенным ниже инструкциям.

• Предоставьте регистратору школы необходимую регистрационную документацию (доказательства проживания, иммунизации, опеки и т. Д.) По EMAIL на [email protected] или по факсу

  на 251-221- 1167. Включите свой контактный номер и имя студента.

• Процесс зачисления не завершен до тех пор, пока онлайн-запись не будет EDITED, и необходимые документы для зачисления не будут предоставлены школьному регистратору, а онлайн-запись в SEALED на новый год.

Два текущих подтверждения места жительства требуются, если вы:

Требуется: Одно (1) доказательство, отражающее физическое место жительства:

• Налог на недвижимость

• Документ о собственности

• Страховой полис домовладельцев

• Выписка по ипотеке

• Аренда квартиры или дома

• Страховой полис арендатора или жилищный договор

• Счета за коммунальные услуги или квитанции об оплате коммунальных услуг

  Вода / газ / телефон / электричество / кабель / мусор

• Отчеты по подоходному налогу от IRS к родительскому / опекунскому

• Прочие официальные подтверждения — корреспонденция из отдела социального обеспечения, DHR, отдела продовольственных талонов или временной помощи ce to Needy Families (TANF)

• Банковские записи, проверка, сбережения, ссуды, инвестиции

• Записи о трудоустройстве — проверка компании, подтверждающее письмо от работодателя

НОВЫЕ ученики в государственной школе Mobile County Система — Документация, необходимая для регистрации:

1. Два действующих документа, подтверждающих проживание на имя родителя / опекуна

2. Удостоверение личности родителя / опекуна с фотографией

3. Свидетельство о рождении учащегося

4. Судебные документы (если применимо)

5. Карточка социального обеспечения учащегося

6. Свидетельство о вакцинации Алабамы

7. Школьные записи из предыдущей школы 67

   1

   • Документы об отчислении вместе с предыдущей контактной информацией из школы

   • Итоговая табель успеваемости за 2019-20 учебный год

   • IEP или план 504 (если применимо)

   Для новых студентов и / или вернувшихся студентов с изменением адреса , у которых НЕТ документа, подтверждающего проживание на имя родителя / опекуна, необходимо будет пройти онлайн-аттестацию в окружном офисе MCPSS, см. Опубликованное письмо округа на сайте школы.Щелкните здесь — Форма оценки зачисления

   Если у вас есть какие-либо вопросы, у вас нет доступа к Интернету или вам нужна помощь относительно ПРОЦЕССА ОЦЕНКИ ЗАПИСИ, позвоните по номеру 251-221-7777, вариант № 6.

   Важно, чтобы всех возвращающихся студентов завершили процесс регистрации / зачисления на 2020-2021 годы как можно скорее! Мы хотим убедиться, что ваш ребенок включен в список на следующий учебный год, и предотвратить любые задержки с началом следующего учебного года.

   Сильвия Хутто,

   Регистратор, Начальная школа Дэвиса

   [email protected] 251-221-1166 Окружная горячая линия MCPSS 251-221-7777

   «Скрытая жемчужина», ставшая популярной благодаря TikTok, закрыта, чтобы не пускать в нее посторонних

   HIGH BRIDGE, Нью-Джерси — Озеро Солитьюд не было.

   В течение многих лет живописное озеро площадью 35 акров, водопад и вековая плотина были нетронутым сокровищем для местных жителей, но благодаря силе социальных сетей секрет раскрылся.

   Люди стали прибывать, принося портативные колонки, детей и еду, а также оставляя мусор. Власти района установили дополнительные мусорные баки и переносные туалеты, а также пригласили полицейских для управления движением — многие автомобили с номерными знаками Нью-Йорка. В последнее воскресенье некоторым посетителям пришлось отказаться.

   Жители насмотрелись. В этом месяце они собрались на виртуальном собрании в стиле ратуши, требуя, чтобы озеро Солитьюд было закрыто. На прошлой неделе район Хай-Бридж подчинился, закрыв территорию для всех посетителей.

   Некоторые жалобы связаны с опасениями, что посетители могут занести коронавирус из Нью-Йорка, примерно в 50 милях к востоку от района. Но некоторые из них прямо делали акцент на этнической принадлежности.

   Высокий мост почти на 95 процентов белый, но озеро привлекает гораздо более разнообразную группу.

   В прошлые выходные, когда было открыто озеро Солитьюд, матери и отцы гребли с малышами под брызгами водопада, бабушки купались ногами в буколической реке, а люди 20-летнего возраста фотографировались с дронов у внушительной плотины.

   «У нас есть толпы испанцев, проживающих за пределами штата, и они оставляют свое дерьмо на земле», — сказал 58-летний Лестер Томсон, который регулярно ловил рыбу в ручье.

   Г-н Томсон, зарегистрированный демократ, является одним из многих людей, которые в социальных сетях и в беседах предлагали вызвать в парк иммиграционную и таможенную службу.

   «Это не расизм, — сказал он в интервью. «Это то, где вы наблюдаете за вещами, и ваши наблюдения основаны на фактах, а не на расизме».

   Озеро Солитьюд — один из нескольких обычно тихих оазисов для местных жителей, которые недавно были захвачены однодневными путешественниками из Нью-Йорка (где общественные пляжи и бассейны были в основном закрыты до этого месяца), которые ищут более близкие места для посещения из-за пандемии .

   В Вудстоке, штат Нью-Йорк, примерно в двух часах езды к северу от Манхэттена, городские власти заявили, что им пришлось закрыть свои популярные бассейны Big Deep и Little Deep из-за «мусора и беспорядка, оставленного посетителями», что затрудняло «обеспечение безопасности. во время пандемии.

   В другом месте в Катскиллс более 300 человек собрались на митинг в стиле ратуши, проведенный на открытом воздухе на прошлой неделе, чтобы пожаловаться на движение транспорта и мусор, принесенный посторонними на водопад Каатерскилл, особенно в его популярные места для плавания, Fawns Leap и Dog Hole .

   Округ Грин, где находится водопад Каатерскилл, более 96 процентов составляют белые. Но Дэрил Легг, городской смотритель Хантера, где находится водопад, отверг идею о том, что раса могла сыграть какую-либо роль в жалобах.

   «Люди приходят сюда, чтобы полюбоваться пейзажем и красотой этого места, — сказал он, — но оставляют красные чашки Solo на дне плавательной ямы, и люди испражняются и мочатся в лесу, и это пахнет уборной после Вудстока.

   Но напряженность была особенно острой в Нью-Джерси, где официальные лица штата в апреле предоставили муниципалитетам широкие полномочия по закрытию общественных парков в качестве способа сдерживания коронавируса.

   В округе Оушен власти округа Лейкхерста указали на перенаселенность в своем решении закрыть озеро Хорикон для посетителей в мае, на следующий день после того, как штат вновь открыл парки округа и штата. В Лонг-Бранч, графство Монмут, в этом месяце полиция временно заблокировала доступ к пляжу после того, как поток посетителей пляжа сделал социальное дистанцирование невозможным.

   В Хай-Бридж на прошлой неделе решение закрыть озеро Солитьюд было принято из соображений охраны здоровья и из-за того, что, по словам мэра района Мишель Ли, парковка была заполнена.

   Но тремя днями ранее, во время виртуальной встречи, в некоторых публичных комментариях приводились другие причины: один мужчина заявил, что чувствовал себя в опасности после того, как мужчина, посетивший озеро, сказал своей жене: «Hola, señorita».

   «Мы инклюзивное сообщество. Мы собираемся принимать всех, независимо от расы, веры или того, кого вы любите », — сказал мэр Ли, демократ.«Мы сделали то, что должны были сделать, потому что это действительно стало проблемой для безопасности».

   Мэр сказал, что толпа резко выросла после того, как видео в TikTok, в котором сайт назван «скрытой жемчужиной», стало вирусным.

   Г-жа Ли сказала, что решение района не имело ничего общего с какой-либо явной или скрытой ксенофобией или расизмом — как, например, дискуссии о чистоте «тех людей», которые недавно можно было услышать за пинтами пива Keepin ‘Local во внутреннем дворике дома. местная пивоварня и пивной ресторан.

   «Я нахожу такие комментарии более отвратительными, чем любой мусор, который я видел, оставленный на озере», — сказал мэр Ли.

   На озере Солитьюд за день до его закрытия земля была нетронутой, и немногие люди, наслаждающиеся парком, чувствовали, что это проблема.

   «Люди просто ищут предлог, чтобы не иметь рядом цветных людей, чтобы вывести нас из их города», — сказал 26-летний Алей Родригес, водитель грузовика, который приехал из Верхнего Манхэттена со своей семьей, чтобы посетить озеро и достопримечательности на холмистой местности, такие как остатки кузницы Union Iron Works, где выплавляли ядра для Войны за независимость.

   «У цветного человека всегда есть цель на спине», — сказал он. «Вы всегда должны быть начеку, даже на красивом озере, куда мы приезжаем повеселиться».

   Недалеко от г-на Родригеса мужчина, представившийся жителем Хай-Бриджа, но назвавший только свое имя, Майк, фотографировал людей, плавающих, с помощью объектива с дальним радиусом действия.

   «Я документирую проблему», — сказал мужчина, который был белым, объяснив, что он зол на то, что купальщики не носили маски во время плавания, и беспокоился, что люди, играющие в воде, загрязняют его.

   Эдвард Бельчик, 74 года, слышал разговоры о перенаселенности и хотел убедиться в этом сам, сказал он. Он был одним из нескольких жителей, которые гуляли по парку с фотоаппаратами, чтобы задокументировать заявления. «Они сказали, что Латинские короли пометили этот район», — сказал г-н Бельчик.

   В течение нескольких недель мэр Ли, финансовый консультант, которая не берет зарплату за свою должность в городке, настаивала на том, чтобы парк оставался открытым. По ее мнению, новички могут помочь сделать Хай-Бридж туристическим направлением. «Если мы все сделаем правильно, это будет отличная ситуация для города», — сказала она.

   Планируется выяснить, как вновь открыться и разместить любую толпу, сказал мэр, но пока нет сроков для этого.

   Некоторые жители района говорят, что они не могут не чувствовать, что за желанием закрыть озеро стоят более уродливые побуждения.

   В кафе Scout’s Coffee Bar & Mercantile на Мейн-стрит глаза хозяйки наполнились слезами, когда она вспомнила слова, которые она произнесла о посетителях, которых она подслушала за стойкой своего бариста. Всего месяц назад на улице прошел митинг Black Lives Matter.

   «Мы только что прошли через все протесты, и все мы узнаем, как мы можем быть лучшими союзниками для цветных людей, и это наша возможность. Это обескураживает », — сказала хозяйка, Николь Поко, 38 лет, белая. «Такое ощущение, что предстоит еще много работы».

   Политика Великобритании в отношении секс-работы: широко закрытые глаза на добровольную секс-работу и секс-работу в помещении

   Страница из

   НАПЕЧАТАНО ИЗ ПОЛИТИЧЕСКОЙ ПРЕССЫ СТИПЕНДИИ ОНЛАЙН (www.policypress.universitypressscholarship.com). (c) Copyright Policy Press, 2021.Все права защищены. Индивидуальный пользователь может распечатать PDF-файл одной главы монографии в PPSO для личного использования. Дата: 25 апреля 2021 г.

   Глава:

   (стр.67) Четыре политики Великобритании в отношении секс-работы: широко закрытые глаза на добровольную секс-работу и секс-работу в помещении

   Источник:

   Регулирование секса для продажи

   Автор (ы):

   Тила Сандерс

   Издатель:

   Policy Press

   DOI : 10.1332 / policypress / 9781847421067.003.0004

   В этой главе исследуется влияние государственной политики с 2004 года на внутренние рынки женского секса и мужчин, покупающих секс у женщин. Он ориентирован на продажу прямых сексуальных услуг, а не косвенных сексуальных услуг, таких как танцы на коленях, секс-работа по телефону и раздевание. Цель главы — изучить позицию правительства в отношении секс-работы в помещении в отличие от уличной проституции. Возникает вопрос, почему правительство отказывается признавать, обсуждать или делать положения о добровольной секс-работе, выходящие за рамки криминализации.В главе исследуются причины «снижения спроса», механизмы для этого и критически обсуждаются последствия и реалии запрета покупки секс-услуг. Он рассматривает два основных правительственных документа: консультацию Paying the Price (Home Office, 2004) и итоговую версию A Coordinated Prostitution Strategy (Home Office, 2006).

   Ключевые слова: внутренние секс-рынки, прямые сексуальные услуги, уличная проституция, повестка дня по криминализации, борьба со спросом, расплата по цене, стратегия скоординированной проституции

   Для получения доступа к полному тексту книг в рамках службы для получения стипендии

   Policy Press Online требуется подписка или покупка.Однако публичные пользователи могут свободно искать на сайте и просматривать аннотации и ключевые слова для каждой книги и главы.

   Пожалуйста, подпишитесь или войдите для доступа к полному тексту.

   Если вы считаете, что у вас должен быть доступ к этой книге, обратитесь к своему библиотекарю.

   Для устранения неполадок, пожалуйста, проверьте наш Часто задаваемые вопросы, и если вы не можете найти там ответ, пожалуйста, свяжитесь с нами.

   Дверь

   закрыта для миллионов американских домовладельцев, нуждающихся в помощи по ипотеке, поскольку пандемия входит в год 2

   Хизер Морони и Джереми Кнапп, которым уже за 40, пытаются наскрести достаточно денег, чтобы спасти свое четырехкомнатное озеро Бонни, штат Вашингтон ., дом, который они купили в 2007 году незадолго до обвала рынка жилья.

   Они боролись с ипотекой до начала пандемии и пытались изменить ссуду, которая имеет фиксированную ставку почти 4,9%, но их ипотечный сервис, Select Portfolio Servicing, потребовал единовременную выплату, которую они не могли себе позволить. — говорит Мороний. Кнапп, терапевт компании по уходу за больными на дому, потерял большую часть своего дохода из-за того, что клиенты отменили встречи, когда начался кризис COVID-19. Однако вместо того, чтобы предложить помощь в связи с пандемией, SPS перешла к лишению права выкупа пары, говорят Кнапп и Морони.В последние месяцы домовладельцы заявляют, что они были посредниками с SPS, пытаясь договориться о доступном плане погашения.

   Мысль о потере дома немыслима, — говорит Мороний. «Нам некуда идти».

   «Право должно основываться на потребностях заемщика, а не на том, кто владеет ссудой».

   Эрик Каплан, Центр финансовых рынков Института Милкена

   SPS, дочерняя компания Credit Suisse не ответил на запросы о комментариях.

   Заем Морони и Кнаппа — это одна из примерно 14,5 миллионов ипотечных кредитов на одну семью — около 30% от общей суммы непогашенных — которые находятся в частной собственности и не имеют федеральной поддержки. В то время как домовладельцы с ипотечными кредитами, поддерживаемыми федерально зарегистрированными Fannie Mae или Freddie Mac или федеральным правительством, могут иметь право на воздержание в связи с пандемией на срок до 18 месяцев и защищены мораторием на выкуп, который действует до конца июня, среди других средств защиты, не существует общенациональной помощи по кредитам, не обеспеченным федеральной поддержкой.

   Результат: заемщикам, не имеющим поддержки на федеральном уровне, иногда предлагают только краткосрочную приостановку платежей и относительно недоступные планы погашения, а в худшем случае они не получают никакой помощи и теряют свои дома во время пандемии. Их судьба часто зависит от личности заемщика. Многие из этих ссуд хранятся в банковских портфелях, где банк может по своему усмотрению предлагать тот тип помощи, который он считает нужным, в то время как другие принадлежат более мелким инвесторам или упакованы в ценные бумаги частной марки, где документы по сделке могут определять, какие типы службы помощи могут предложить заемщикам.

   Это оставляет заемщиков незащищенными, поскольку пандемия пробивает бреши в жилищной безопасности страны. По данным Black Knight, поставщика данных по ипотеке, по состоянию на январь количество серьезных просрочек по ипотеке в пять раз превышало уровень до пандемии.

   Специалисты по обслуживанию говорят, что они вносят свой вклад в помощь заемщикам. «Наша цель №1 — удерживать людей в своих домах», — говорит Кармен Белл, руководитель группы обслуживания по умолчанию в Wells Fargo. Она говорит, что банк «придерживается того же подхода» к ипотечным кредитам, которые не имеют федеральной поддержки, чем те, которые есть, за исключением случаев, когда частные инвесторы устанавливают лимиты на облегчение.

   В идеале «помощь должна основываться на потребностях заемщика, а не на том, кто владеет ссудой, — говорит Эрик Каплан, старший советник Центра финансовых рынков Института Милкена, — но нельзя игнорировать существующие правила». и возражения потенциальных инвесторов. Защитники прав потребителей призывают законодателей расширить права домовладельцев на воздержание и другие выплаты. Конгрессу следует потребовать от частных займов принять мораторий на потерю права выкупа, планы воздержания и варианты платежей после воздержания, аналогичные тем, которые доступны заемщикам с федеральной поддержкой, и предоставить обслуживающим компаниям, которые следуют этим положениям, безопасную гавань от судебных исков инвесторов, Никитра Бейли, исполнительный вице-президент Центра Ответственное кредитование, заявил 16 марта подготовил свидетельские показания перед Банковским комитетом Сената.

   Эти меры защиты могли иметь большое значение для 44-летней Жакара Фэрбенкс, матери-одиночки из Пуйаллапа, штат Вашингтон, чей дом был продан в результате потери права выкупа прошлой осенью. До начала пандемии она не выплачивала ипотеку, не обеспеченную федеральным фондом, и в 2019 году ей грозила потеря права выкупа, прежде чем она получила модификацию ссуды, которая потребовала 12 месяцев пробных платежей. Соглашение о внесении изменений включало некоторые строгие условия: если Фэрбенкс не производил ежемесячный платеж или просрочивался более чем на 30 дней, она соглашалась на потерю права выкупа, согласно копии соглашения, включенной в судебные документы.

   Фэрбенкс произвел пять платежей в соответствии с новым соглашением, но в начале 2020 года снова задержался, согласно материалам суда. По словам Фэрбенкса и ее адвоката Дэвида Смита, после того, как разразилась пандемия, она потеряла работу помощника бухгалтера и обратилась к своему ипотечному агенту, FCI Lender Services, с просьбой о помощи. Но инвестор, владеющий ипотекой, не допустил бы снисходительности, по словам Фэрбенкса, Смита и Шелли Доран, консультанта по жилищным вопросам в некоммерческой организации Parkview Services из Шорлайн, Вашингтон, которая начала работать с Фэрбенксом в ноябре.

   «Инвесторы указывают FCI, что делать, а что не делать», — говорит Майкл Гриффит, президент и генеральный директор FCI. «FCI не имеет права требовать разрешений, модификаций и т. Д.»

   Инвестором ссуды Фэрбенкса был фонд Residential Credit Opportunities Trust VC, управляемый American Mortgage Investment Partners Management из Сил-Бич, Калифорния. Рон МакМахан, генеральный директор AMIP, сказал, что фирма «действительно оказала ей помощь», но отказался сообщить подробности , заявив, что не может комментировать конкретного заемщика.«Нет ни одного заемщика, с которым мы имели дело за последние семь или восемь месяцев, которому мы прямо отказали бы в доступе к плану воздержания», — сказал он.

   Изъятие права выкупа «не окончательное», — говорит МакМахан. «Это является предметом текущих судебных разбирательств».

   Судебные документы показывают, что кредитор возобновил процесс обращения взыскания в конце апреля 2020 года. В заявлении доверенного лица Residential Credit Opportunities от ноября 2020 года говорится, что фирма приступила к обращению взыскания после того, как Фэрбенкс не смог произвести платежи в феврале, марте и апреле 2020 года.

   По словам Фэрбенкс, из-за того, что школы ее детей были закрыты, было невозможно вернуться к работе. В отчаянии она обратилась за помощью к третьим сторонам, в том числе к Home Matters USA, фирме из Лос-Анджелеса, которая, по словам Фэрбенкс, взимала с нее тысячи долларов и сообщила, что справляется с ситуацией, но в конечном итоге ничего не сделала, чтобы помочь ей. Компания Home Matters не ответила на запросы о комментариях.

   Зная о том, что дело о выкупе заложено, Фэрбенкс связалась с агентом по недвижимости, чтобы продать ее дом, что, вероятно, позволит ей уйти с более чем 100 000 долларов в капитале, говорит она.Но компания Home Matters уверяла ее, что она не потеряет свой дом, говорит она, и на жарком рынке жилья в районе Сиэтла и Такомы она знала, что ей нужно найти новое место для жизни, прежде чем сдавать свой дом. рынок. Прежде, чем она смогла действовать, ее дом был продан на аукционе выкупа в октябре прошлого года.

   «Суть в том, что она не выполнила свои обязательства по модификации», — говорит Гриффит из FCI. «Кредитор решил больше не работать с ней и забрал ее дом».

   На данный момент Фэрбенкс и ее семья остаются в доме, пока она борется в суде, чтобы спасти свой дом, утверждая, что заявление о банкротстве, поданное ею в дни после аукциона по выкупу заложенного имущества, должно было остановить передачу права собственности новому владельцу, ожидающую решения. судебное рассмотрение.В январе судья Суда США по делам о банкротстве Западного округа Вашингтона вынес решение в пользу Фэрбенкса. Апелляция находится на рассмотрении.

   «Я просто пытался осуществить американскую мечту, как и все остальные», — говорит Фэрбенкс. «Я сделал это сам, просто чтобы показать своим детям лучшую жизнь. И кто бы мог знать, что мы будем иметь дело с COVID-19? » У нее нет семьи, к которой она могла бы переехать, говорит она, и «у меня нет никого, кому я могу позвонить и сказать:« Могу ли я и мои дети остаться с тобой? »Как я могу посмотреть на своих детей и сказать: «Нам нужно съехать»? »

   Многие бедствующие домовладельцы с ипотечными кредитами, не поддерживаемыми государством, получили отсрочку в связи с пандемией, но в некоторых случаях она длится недолго — например, три месяца, — говорят консультанты по жилищным вопросам и домовладельцы.По данным Black Knight, около 5% кредитов, не обеспеченных федеральным фондом, на конец февраля находились в отсрочке, что соответствует доле всех ипотечных кредитов, которым была предоставлена ​​такая помощь.

   Для домовладельцев, которые хотят продлить периоды воздержания, некоторые сервисные центры требуют каждый месяц новую документацию, что «создает огромную неопределенность и дополнительное бремя, в котором на самом деле нет необходимости», — говорит Лиза Ситкин, старший поверенный штата в National Проект жилищного права.

   Настоящие проблемы часто начинаются, когда заканчивается терпение.Некоторые сервисные центры просят заемщиков выплатить уплаченную сумму единовременно или разработать план ежемесячных выплат, который домовладелец не может себе позволить, в то время как другие предлагают более удобные для заемщика варианты, такие как отсрочка удержанной суммы до конца срока ссуды. Домовладельцы с Fannie Mae, Freddie Mac и государственными кредитами не обязаны делать единовременное погашение при выходе из режима воздержания от COVID, и они часто имеют доступ к упрощенным опциям, которые позволяют им возобновить свои предыдущие графики платежей, откладывая пропущенные платежи до конца срока кредита.

   Значительная доля домовладельцев недавно вышла из режима снисходительности из-за просроченных платежей и отсутствия плана по снижению убытков. В некоторых случаях это связано с тем, что обслуживающие компании не могут связаться с заемщиками или потому, что требуется время для обработки изменений, говорит Майк Фратантони, старший вице-президент и главный экономист Ассоциации ипотечных банкиров. По данным ассоциации, за неделю, закончившуюся 14 марта, около 22% заемщиков, не получивших федеральной поддержки, и 20% всех заемщиков, отказавшихся от отсрочки платежа, не имели текущих кредитов и не имели плана погашения или изменения кредита.

   Возможности помощи для некоторых домовладельцев ограничены, поскольку их ипотечные кредиты являются частью рынка ценных бумаг под частной торговой маркой, который взорвался во время последнего финансового кризиса, но начал возвращаться до пандемии. Документы, которые регулируют обслуживание ссуд в этих ценных бумагах, иногда расплывчаты, оставляя варианты помощи открытыми для интерпретации обслуживающего персонала, в то время как в других случаях они предоставляют обслуживающему персоналу «извращенные стимулы», говорит Каплан, например, уплата им более высоких комиссий за обслуживание ссуд, находящихся в бедствия, или свяжут руки обслуживающему персоналу, который в противном случае предложил бы более щедрые варианты воздержания.

   Ocwen Financial Corp. заявляет, что стремится одинаково относиться ко всем заемщикам, независимо от того, кому принадлежит заем. «Единственное исключение — [когда] конкретный инвестор говорит нам не делать этого», — говорит Скотт Андерсон, исполнительный вице-президент и директор по обслуживанию. «Это может случиться — это их заем». По его словам, в большинстве случаев таких ограничений не возникает.

   Wells Fargo заявляет, что также пытается расширить те же возможности для всех заемщиков, но в некоторых случаях частные инвесторы ограничивают отсрочку до шести месяцев, говорит Белл, а в редких случаях — всего до двух месяцев.По мере того, как сильно пострадавшие домовладельцы пытаются продлить период приостановленных платежей, «в частном секторе, вероятно, будет больше клиентов, которые не смогут продолжить отсрочку», — говорит она, хотя они могут иметь право на изменение ссуды или другие альтернативы. . По ее словам, некоторые инвесторы установили ограничение на количество месяцев, на которые могут быть отложены платежи, которые могут быть отложены до конца ссуды.

   В некоторых случаях сервисные центры могут оспорить такие ограничения, говорят защитники прав потребителей. В соответствии с программой федерального правительства по доступным модификациям жилья, или HAMP, созданной в 2009 году в ответ на кризис отчуждения права выкупа, участвующие обслуживающие компании должны были просить инвесторов снять ограничения, которые блокировали изменение ссуд.Хотя Wells Fargo действительно взаимодействует с частными инвесторами, «относительно редко они дают нам право не следовать их задокументированным инструкциям и своим контрактам», — говорит Белл.

   В случае ссуд под ценные бумаги под частной торговой маркой не всегда ясно, кто имеет право принимать решение об условиях любых льгот, предлагаемых заемщикам: это может быть инвестор, доверительный управляющий, администратор облигаций или другая сторона. «Заинтересованные стороны в этой сделке должны собраться вместе и выяснить, какие меры по снижению убытков и условия они собираются предложить», — говорит Каран Каул, старший научный сотрудник Центра политики жилищного финансирования Urban Institute.Более того, «часто допускаются ошибки» при толковании соглашений об объединении и обслуживании, говорит Ситкин из Национального проекта жилищного права, добавляя, что во время кризиса отчуждения права выкупа у нее было много случаев, когда обслуживающие организации заявили, что были связаны ограничениями инвесторов на модификации, которые не были подтверждается самими документами.

   Бюро финансовой защиты потребителей хочет внимательно следить за вариантами погашения после воздержания, которые предлагаются заемщикам, чьи ипотечные ссуды не поддерживаются государством, говорит представитель бюро, и работает с другими федеральными агентствами над рекомендациями по вариантам после воздержания и обращению взыскания.Бюро заявляет, что его цель — гарантировать, что никто не будет направлен на обращение взыскания без оценки всех других альтернатив.

   Федеральное агентство жилищного финансирования, которое курирует Fannie Mae и Freddie Mac, заявило, что оно стремится сохранить защиту заемщиков, ссуды которых продаются двумя ипотечными гигантами. Сенатор-демократ Шеррод Браун и Джек Рид из Огайо и Род-Айленда, соответственно, подняли тревогу в последние месяцы по поводу необслуживаемых и пересматриваемых кредитов, проданных Fannie Mae и Freddie Mac во время пандемии, заявив, что продажи могут стоить заемщикам федеральных мер защиты от снисходительности и исключать их из Моратории Fannie и Freddie на выкуп заложенного имущества.(Реформирование ссуд было просрочено, но теперь они текущие.)

   В письме Брауну и Риду в конце февраля директор FHFA Марк Калабрия сказал, что около 42000 из примерно 95000 проданных ссуд были перепроектированы в ценные бумаги, обеспеченные Fannie или Freddie, и будут сохраняют защиту, предусмотренную законом CARES, в то время как остальные были проданы по сделкам, которые требуют от покупателей и обслуживающих компаний соблюдения любых существующих планов воздержания, действующих на момент продажи, и определения приоритетов альтернативных вариантов потери права выкупа. FHFA поручил Fannie и Freddie потребовать, чтобы кредиты, проданные в будущем, сохраняли защиту от выкупа и воздержания от COVID, пишет Калабрия.

   «бесит», что всем заемщикам не была предоставлена ​​одинаковая защита во время пандемии, — говорит 37-летний Бенджамин Янцевич, домовладелец из Балтимора.

   После того, как в 2019 году авария на мотоцикле лишила его работы в течение шести месяцев, по словам Янцевича, он был банкротом, когда разразилась пандемия и унесла 75% его дохода как художника-графика. Когда он вышел из банкротства, он обратился к своему ипотечному агенту, Shellpoint Mortgage Servicing, с просьбой о помощи в связи с пандемией, но его просто попросили заполнить одни и те же формы несколько раз, но безрезультатно, говорит он.«Я начал просто паковать коробку каждую неделю или около того», думая, что он потеряет свой дом, — говорит Янцевич, родитель-одиночка с двумя детьми среднего школьного возраста.

   В последние недели он наконец получил документы для модификации ссуды, которая делает его ежемесячные платежи доступными, но требует крупномасштабного платежа в конце срока ссуды. «Я думаю, что это единственный вариант, который у меня сейчас есть», — говорит Янцевич. Shellpoint, подразделение New Residential Investment Corp., не ответила на запросы о комментариях.

   Белковая O-глюкозилтрансфераза Руми изменяет закрытые глаза, способствуя разделению рабдомеров у дрозофилы

   Abstract

   Белок O -глюкозилтрансфераза Rumi / POGLUT1 регулирует передачу сигналов Notch Drosophila путем добавления O -глюкозных остатков во внеклеточный домен Notch. У Руми есть и другие предсказанные цели, включая Crumbs (Crb) и Eyes closed (Eys), оба из которых участвуют в развитии фоторецепторов. Однако остается неизвестным, требуется ли Руми для функционирования Crb и Eys.Здесь мы сообщаем, что в отсутствие Rumi или его ферментативной активности несколько рабдомеров в каждом омматидиуме не могут отделиться друг от друга Notch-независимым образом. Масс-спектральный анализ указывает на присутствие O -глюкозы на Crb и Eys. Однако мутация всех O -глюкозилированных сайтов в crb knock-in аллеле не вызывает прикрепления рабдомеров, исключая Crb как биологически значимую мишень для Rumi в этом процессе. Напротив, eys и rumi демонстрируют зависимое от дозировки генетическое взаимодействие.Кроме того, хотя у омматидий дикого типа большая часть белка Eys находится в межрабдомеральном пространстве (IRS), у мутантов rumi значительная часть Eys остается в фоторецепторных клетках. Внутриклеточное накопление Eys и дефект IRS ухудшаются у мутантов rumi , выращенных при более высокой температуре, и сопровождаются снижением общего уровня Eys на ~ 50%. Более того, удаление одной копии шаперона эндоплазматического ретикулума усиливает прикрепление рабдомеров у мутантных животных rumi .В целом, наши данные подтверждают, что O -глюкозилирование Eys с помощью Rumi обеспечивает разделение рабдомеров, способствуя правильному складыванию Eys и стабильности в критическом временном окне во время стадии середины куколки. Человеческий EYS, который мутирован у пациентов с аутосомно-рецессивным пигментным ретинитом, также содержит несколько сайтов-мишеней Rumi. Следовательно, роль O -глюкозы в регуляции Eys может быть сохранена.

   Сведения об авторе

   Гликозилирование (добавление сахаров к белкам и другим органическим молекулам) важно для функционирования белков и развития животных.Каждая форма гликозилирования обычно присутствует на нескольких белках. Следовательно, основная проблема в понимании роли сахаров в развитии животных состоит в том, чтобы определить, какой белок (белки), модифицированный определенным сахаром, требует модификации сахара для надлежащей функциональности. Ранее мы показали, что фермент под названием Rumi добавляет молекулы глюкозы к важному рецептору клеточной поверхности под названием Notch, и что глюкоза играет ключевую роль в функции Notch как у плодовых мушек, так и у млекопитающих. Используя дрозофилы, мы определили новую цель Руми под названием «Глаза закрыты», секретируемый белок, играющий критическую роль в оптической изоляции соседних фоторецепторов в глазу мух.Наши данные предполагают, что молекулы глюкозы на закрытых глазах способствуют их складыванию и стабильности в критическое временное окно во время развития глаза. Мутации в закрытых глазах человека приводят к разрушительной форме дегенерации сетчатки и потере зрения. Поскольку предполагается, что закрытые глаза человека также содержат молекулы глюкозы, наша работа обеспечивает основу для изучения роли модификаций сахара в биологии белка болезни человека.

   Образец цитирования: Haltom AR, Lee TV, Harvey BM, Leonardi J, Chen Y-J, Hong Y, et al.(2014) Белок O -глюкозилтрансфераза Rumi изменяет закрытые глаза, способствуя разделению рабдомеров у Drosophila . PLoS Genet 10 (11): e1004795. https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1004795

   Редактор: Норберт Перримон, Гарвардская медицинская школа, Медицинский институт Говарда Хьюза, Соединенные Штаты Америки

   Поступила: 18 июня 2014 г .; Одобрена: 2 октября 2014 г .; Опубликован: 20 ноября 2014 г.

   Авторские права: © 2014 Haltom et al.Это статья в открытом доступе, распространяемая в соответствии с условиями лицензии Creative Commons Attribution License, которая разрешает неограниченное использование, распространение и воспроизведение на любом носителе при условии указания автора и источника.

   Доступность данных: Авторы подтверждают, что все данные, лежащие в основе выводов, полностью доступны без ограничений. Все соответствующие данные находятся в документе и его файлах с вспомогательной информацией.

   Финансирование: Мы выражаем признательность за поддержку со стороны Mizutani Foundation for Glycoscience (грант № 110071 для HJN), NIH / NIGMS (R01GM084135 для HJN и R01GM061126 для RSH), ядра конфокальной микроскопии BCM IDDRC240 (5P30HD0; Shriver NICHD), Bloomington Drosophila Stock Center (NIH P40OD018537) и BCM Integrated Microscopy Core, который финансируется NIH (HD007495, DK56338 и CA125123), Dan L.Онкологический центр Дункана и Консорциум химической геномики Джона С. Данна на побережье Мексиканского залива. Финансирующие организации не играли никакой роли в дизайне исследования, сборе и анализе данных, принятии решения о публикации или подготовке рукописи.

   Конкурирующие интересы: Авторы заявили об отсутствии конкурирующих интересов.

   Введение

   Дневные насекомые обладают «аппозиционными глазами», в которых омматидии оптически изолированы друг от друга [1], [2]. У большинства дневных насекомых, таких как пчелы и бабочки, апикальные структуры, вмещающие родопсин, каждого омматидия — рабдомеры — сливаются в центре.Это позволяет группе фоторецепторов в каждом омматидии действовать как единое оптическое устройство [1]. Модификация аппозиционного глаза возникла во время эволюции насекомых у двукрылых мух, где образуется внеклеточный просвет, называемый межрабдомеральным пространством (IRS), для разделения и оптической изоляции рабдомеров в каждом омматидии друг от друга. Из-за этой структурной модификации и сопутствующей перегруппировки аксонов фоторецепторов среди соседних омматидий информация от фоторецепторных клеток, которые получают свет из одной и той же точки в пространстве, сливаются с одними и теми же постсинаптическими мишенями в пластинке [3].Этот тип глаза называется глазом с наложением нейронов, и эти улучшения позволяют повысить светочувствительность без ущерба для разрешения [1], [4].

   Разделение рабдомеров у мух требует эволюционно законсервированного секретируемого гликопротеина, который называется Eyes shut (Eys; также называемый Spacemaker). eys мутантные мухи лишены IRS и демонстрируют измененную организацию фоторецепторов, которая напоминает закрытый рабдом других насекомых, таких как медоносные пчелы и комары [5], [6].Eys секретируется из стеблевой мембраны фоторецепторных клеток Ire1-зависимым, но Sec6-независимым способом для разделения рабдомеров и открытия IRS [5], [7]. Drosophila eys функционирует вместе с тремя другими генами, crumbs ( crb ), prominin ( prom ) и chaoptin ( chp ), чтобы регулировать разделение рабдомеров и размер IRS [5], [5], [5] 6], [8], [9]. Генетические эксперименты установили, что prom и eys способствуют разделению рабдомеров, но chp и crb способствуют адгезии рабдомеров, и что баланс между их активностями приводит к правильному образованию IRS [6], [8], [9] .

   Внеклеточный домен Crb и белок Eys в основном состоят из повторов, подобных эпидермальному фактору роста (EGF), и доменов ламинина G [5], [6], [10], [11]. Однако роль этих белковых доменов и их посттрансляционных модификаций в функции Eys и Crb неизвестна. Пять повторов Eys EGF и семь повторов Crb EGF содержат консенсусную последовательность C ¹ XSX (P / A) C ² , которая предсказывает добавление глюкозы, связанной с O , к белку O . -глюкозилтрансфераза Руми (POGLUT1 у млекопитающих) [12], [13].Мутации в rumi были впервые выделены в ходе генетического скрининга регуляторов развития сенсорных органов у Drosophila [12]. При выращивании при 18 ° C мутанты rumi жизнеспособны и обнаруживают только умеренную потерю передачи сигналов Notch в определенных контекстах, включая латеральное ингибирование щетинок и образование суставов ног [12], [14]. Однако при выращивании при более высоких температурах мутантные животные обнаруживают широкую и серьезную потерю передачи сигналов Notch, вплоть до 28-30 ° C, при которой потеря rumi становится смертельной для личинок [12], [14], [15].Мыши, лишенные гомолога Rumi POGLUT1, погибают на ранних эмбриональных стадиях (на или раньше E9.5) и некоторые из дефектов, наблюдаемых у мутантных эмбрионов, характерны для потери передачи сигналов Notch [16]. Более того, трансгенная экспрессия человеческого POGLUT1 у мух спасает нулевые фенотипы rumi и , указывая на то, что функция Rumi сохраняется [17]. Drosophila Notch имеет 18 сайтов-мишеней Rumi во внеклеточном домене, большинство из которых, как было подтверждено, содержат O -глюкозных остатков [12], [18].Более того, мутации серина в аланин в сайтах-мишенях Rumi Notch приводят к чувствительной к температуре потере передачи сигналов Notch [14], делая Notch биологически релевантной мишенью для Rumi у мух. Однако остается неизвестным, необходимы ли Rumi и его глюкозилтрансферазная активность для функции других его потенциальных мишеней, таких как Eys и Crb, и для разделения рабдомеров.

   Здесь мы представляем доказательства, указывающие на то, что ферментативная активность Руми необходима для разделения рабдомеров в глазу Drosophila .При выращивании при 18 ° C животные, гомозиготные по нулевому аллелю rumi или по миссенс-мутации, которая отменяет его активность белка O -глюкозилтрансферазы, демонстрируют фенотип прикрепления рабдомера с высокой проникающей способностью, который не может быть объяснен потерей O — глюкоза от Notch. Масс-спектральный анализ показывает, что и Crb, и Eys содержат O -глюкозу при экспрессии в линии клеток мух. Однако генетические эксперименты исключают Crb как цель Руми во время разделения рабдомеров.Наши данные показывают, что O -глюкозилирование Eys с помощью Rumi способствует укладке и стабильности Eys и тем самым гарантирует, что достаточное количество Eys секретируется в IRS в критическое временное окно во время стадии середины куколки для полного разделения рабдомеров.

   Результаты

   Мутации в

   rumi приводят к фенотипу прикрепления рабдомеров, который начинается на стадии середины куколки

   При выращивании при 18 ° C животные с мутантами rumi и жизнеспособны и обнаруживают только умеренную потерю передачи сигналов Notch в некоторых контекстах [12], [14].Чтобы выяснить, играет ли Руми роль в морфогенезе рабдомеров и формировании IRS, мы вырастили животных, гомозиготных по нулевому белку аллелю rumi ^Δ26 ( rumi ^— ) при окружающем свете при 18 ° C и выполнили просвечивающую электронную микроскопию. (ТЕМ) на глазах взрослых мух. В поперечных срезах сетчатки дикого типа рабдомеры семи видимых фоторецепторных клеток отделены от соседних рабдомеров с помощью IRS [19] (Рис. 1A и 1F). Однако однодневные животные rumi ^{— / —} проявляли умеренный, но все же 100% пенетрантный фенотип прикрепления рабдомеров, т.е.е. прикрепление двух или более рабдомеров к омматидию (рис. 1B и 1F). Этот фенотип может быть полностью восстановлен с помощью P {rumi ^gt-FLAG } (рис. 1C и 1F), геномного трансгена, экспрессирующего версию Rumi с тегом FLAG [12], что указывает на то, что прикрепление рабдомеров наблюдается у rumi ^{. — / —} мух связано с потерей руми . Срезы rumi ^{— / —} животных в возрасте 15 и 40 дней обнаруживают сходную степень прикрепления рабдомеров, указывая тем самым, что фенотип не зависит от возраста (Рис. 1D – G).Вместе эти наблюдения указывают на то, что Rumi необходим для оптической изоляции индивидуальных фоторецепторов в глазу Drosophila .

   Рис. 1. Потеря ферментативной функции Руми приводит к адгезии рабдомеров.

   Показаны электронные микрофотографии одного омматидия взрослых особей (A – E, H, I) или 65% PD (J, K) указанных генотипов. Всех животных выращивали при 18 ° C. (A) Дикий тип. Стрелки указывают рабдомеры, а звездочки указывают IRS. Шкала шкалы: 2 мкм.(B) 1-дневный руми ^{— / —} . Обратите внимание на прикрепление в соседних рабдомерах. (C) Однодневный возраст rumi ^{— / —} , экспрессирующий геномный трансген P {rumi ^gt-FLAG } дикого типа. (D, E) Фенотип прикрепления рабдомера rumi ^{— / —} не меняется с возрастом, поскольку 15-дневные (D) и 40-дневные (E) животные демонстрируют одинаковую степень привязанности. (F) Процент количества индивидуальных рабдомеров перомматидий для различных генотипов.Для каждого генотипа использовали не менее трех животных. Количество омматидий, исследованных для каждого генотипа, следующее: wt (50), 1d (35), 15d (66), 40d (85), rescue (126). (G) Количественная оценка среднего индивидуального числа рабдомеров на омматидий для данных, показанных в приложениях F. Rhabdomere у 1-дневных, 15-дневных и 40-дневных животных rumi , существенно не отличаются друг от друга, но значительно отличаются от животные дикого типа и спасенные животные (* P <0,0001). NS, не имеет значения.(H, I) Ферментативно неактивный аллель rumi ⁷⁹ также демонстрирует фенотип прикрепления рабдомера (H), который может быть спасен одной копией геномного трансгена P {rumi ^gt-FLAG } дикого типа. (Я). (J, K) Омматидии от животных при 65% PD от дикого типа (J) и руми ^{— / —} (K). Стрелки в (K) указывают точки прикрепления рабдомеров. (L) Средние значения ± SEM площади IRS у дикого типа и руми ^{— / —} при 65% PD. Площадь IRS измеряли с помощью программного обеспечения ImageJ.Непарный t -тест был использован для сравнения wt (n = 14) и rumi ^{— / —} (n = 24) IRS, * P <0,0001.

   https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1004795.g001

   Ранее мы показали, что Rumi в первую очередь регулирует передачу сигналов Notch посредством своего белка O -глюкозилтрансферазной активности [12], [14]. Мы задались вопросом, требуется ли ферментативная активность Руми также для разделения рабдомеров. Чтобы проверить это, мы выполнили ТЕМ на взрослых особях Drosophila , гомозиготных по rumi ⁷⁹ , тяжелому гипоморфному аллелю, несущему миссенс-мутацию, которая отменяет ферментативную активность Rumi, но не влияет на уровень или стабильность его экспрессии [12], [12] [ 17]. rumi ^79/79 животных, выращенных при 18 ° C, также обнаруживают прикрепление рабдомеров у всех исследованных омматидий (рис. 1H; n> 50). Удивительно, но среднее количество отдельных рабдомеров на омматидий было несколько ниже у руми ^79/79 животных (3,41 ± 0,15) по сравнению с руми ^{— / —} животных (4,11 ± 0,08), что указывает на то, что прикрепление рабдомера фенотип несколько более серьезен у животных rumi ^79/79 по сравнению с rumi ^{— / —} животных.Статистический анализ показал, что разница между средним числом рабдомеров ^79/79 и руми ^{— / —} на омматидии значима ( P <0,0001). Учитывая, что руми ^Δ26 является белковым нулевым аллелем [12], эти данные предполагают, что руми ⁷⁹ может иметь доминирующий негативный эффект в контексте разделения рабдомеров. Однако одна копия геномного трансгена P {rumi ^gt-FLAG } смогла полностью восстановить фенотип прикрепления рабдомеров у животных rumi ^79/79 (Рисунок 1I, n> 50).Более того, сверхэкспрессия Rumi-G189E, который является белковым продуктом rumi ⁷⁹ [12], не приводила к каким-либо дефектам разделения рабдомеров, подобно сверхэкспрессии Rumi дикого типа (Рисунок S1). В совокупности эти наблюдения предполагают, что rumi ⁷⁹ вряд ли является доминантным отрицательным аллелем. Поскольку руми ⁷⁹ было сгенерировано на экране EMS, но руми ^Δ26 является продуктом удаления элемента P , умеренное ухудшение прикрепления рабдомера в руми ⁷⁹ могло быть связано с генетический фоновый эффект.Взятые вместе, эти наблюдения показывают, что ферментативная активность Руми необходима для разделения рабдомеров в глазе мух.

   Морфогенез рабдомеров и формирование IRS происходят во второй половине развития куколки [19]. До 37% развития куколки (PD) апикальные поверхности фоторецепторов прикреплены друг к другу и не имеют микровиллярных структур [19]. Около 55% PD, короткие микроворсинки и мембраны соседних стеблей можно увидеть на апикальных поверхностях развивающихся фоторецепторов, и сформировалась тонкая IRS [19].На 65% PD рабдомеры четко отделены друг от друга IRS (рис. 1J). Поскольку сетчатки однодневных взрослых особей rumi имеют хорошо сформированный IRS, но демонстрируют прикрепление рабдомеров (рис. 1B), мы спросили, предотвращает ли отсутствие Rumi разделение рабдомеров во время развития куколки, или они изначально разделяются, но впоследствии прикрепляются к куколке. глаз принимает взрослое строение. Чтобы ответить на этот вопрос, мы выполнили ТЕМ на 65% сетчатках PD rumi ^{— / —} , выращенных при 18 ° C, и обнаружили, что при 65% PD каждый фоторецептор rumi имеет отличную стеблевую мембрану и структуры рабдомеров (рис. 1K ).IRS сформировался, но средний размер IRS у мутантных омматидий (3,52 ± 0,20 мкм ² ) составляет 59% от среднего размера IRS у омматидий дикого типа (5,95 ± 0,19 мкм ² ) на аналогичной стадии, увеличенной на такая же температура (Рисунок 1L, P <0,0001). Хотя апикальные поверхности фоторецепторов, прилегающие к IRS, кажутся отделенными друг от друга, между микровиллярными мембранами соседних рабдомеров (и иногда противоположными рабдомерами) в каждом омматидии сохраняются множественные локальные адгезии (Рис. 1K, стрелки).Эти наблюдения указывают на то, что фенотипы прикрепления рабдомеров rumi очевидны на ранних этапах морфогенеза рабдомеров и убедительно подтверждают, что собственное разделение рабдомеров никогда не происходит у животных rumi ^{— / —} .

   Потеря

   O -глюкозы из Notch не может объяснить фенотип прикрепления рабдомеров rumi животных

   Если Rumi регулирует расстояние между рабдомерами посредством своей активности белка O -glucosyltransferase (Poglut), то недостаток глюкозы в белках-мишенях Rumi, вероятно, ответственен за наблюдаемый фенотип.Чтобы идентифицировать все белки мух с потенциальным сайтом-мишенью для Rumi, мы использовали поисковую систему MOTIF (http://motif.genome.jp/MOTIF2.html) для поиска в базах данных Swiss-Prot и KEGG-GENES Drosophila, несущих белков. один или несколько повторов EGF с консенсусной последовательностью C ¹ XSX (P / A) C ² [13]. Основываясь на этом поиске, 14 белков Drosophila имеют по крайней мере один повтор EGF с предполагаемым целевым сайтом Rumi (рис. 2A), при этом Notch несет наибольшее количество O -сайтов -глюкозилирования, большинство из которых, как было подтверждено, эффективно работают. O -глюкозилированный Руми [12], [13], [18]. rumi нулевых животных, выращенных при 18 ° C, не обнаруживают дефектов спецификации фоторецепторов, характерных для потери передачи сигналов Notch (рис. 2B – D ‘), что позволяет предположить, что передача сигналов Notch существенно не затрагивается в rumi ^{— / —} , развивающиеся фоторецепторы эта температура. Более того, насколько нам известно, передача сигналов Notch не участвует в размещении рабдомеров. Тем не менее, учитывая широкие роли, которые Notch играет во множественных контекстах развития, мы стремились изучить, могут ли дефекты расстояния между рабдомерами, наблюдаемые у мутантов rumi , быть объяснены потерей O -глюкозы из повторов Notch EGF.С этой целью мы использовали геномный трансген Notch ( PBac {N ^gt-4-35 } ), в котором мутации серина в аланин введены во все 18 сайтов-мишеней Rumi и, следовательно, экспрессируют белок Notch, который не может быть O -глюкозилирован Руми [14] (рис. 2E). При выращивании при 18 ° C трансген PBac {N ^gt-4-35 } устраняет летальность нулевых мутаций Notch и N ^–; PBac {N ^gt-4-35 } / + животных демонстрируют только небольшую потерю передачи сигналов Notch, аналогичную мутантам rumi [14].ТЕА: взрослый N ^— ; PBac {N ^gt-4-35 } / + глаза, поднятые при 18 ° C, не обнаруживают каких-либо фенотипов прикрепления рабдомеров (рис. 2F), что убедительно подтверждает мнение о том, что добавление O -глюкозы к Notch не является существенным для правильное расстояние между рабдомерами.

   Рис. 2. Потеря O -глюкозы на Notch не может объяснить фенотип прикрепления рабдомера rumi ^{— / —} .

   (A) Список потенциальных целей Руми среди мух.(B – D ‘) Крупные планы личиночных глазных дисков третьего возраста, показывающие развивающиеся фоторецепторы у wt (B, B’), руми ^{— / —} животных, выращенных при 18 ° C (C, C ‘) и rumi ^{— / —} животных, выращенных при 18 ° C и переведенных на 30 ° C в течение четырех часов перед вскрытием (D, D ‘). Фоторецепторы R8 отмечены Senseless (Sens, красный), а все фоторецепторы отмечены Elav (зеленый). «A» и «p» на панели B показывают переднюю и заднюю части соответственно и относятся к B – D ‘. Стрелки в B ‘и C’ отмечают пронейральные кластеры R8 до того, как один R8 будет выбран посредством Notch-опосредованного латерального ингибирования.У rumi ^{— / —} животных, выращенных при 18 ° C (C, C ‘), пронейральные кластеры R8 трансформируются в отдельные клетки Sens ⁺ R8, которые сами привлекают другие фоторецепторы, аналогично животным дикого типа. (B, B ′). Напротив, выращивание личинок rumi при 30 ° C приводит к спецификации множественных фоторецепторных клеток R8 (область между скобками), указывая на нарушение Notch-опосредованного латерального ингибирования при этой температуре. Обратите внимание, что отбор R8 и рекрутирование фоторецепторов не нарушается в области позади скобок, поскольку животное выращивали при 30 ° C только в течение четырех часов.(E) Схема EGF-повторов геномного трансгена Notch, использованного в исследовании. Синие и оранжевые прямоугольники указывают на повторы EGF, несущие консенсусные последовательности wt и мутантного Rumi соответственно. (F) Электронная микрофотография омматидия животного, экспрессирующего мутантный трансген PBac {Notch ^gt-4-35 } на нулевом фоне Notch при 18 ° C. Шкала шкалы: 2 мкм.

   https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1004795.g002

   Crb является

   O -глюкозилированным, но потеря O -глюкозы из Crb не приводит к присоединению рабдомера

   Белком мухи со вторым по величине количеством сайтов-мишеней для Rumi является Crb (рис. 2A), эволюционно консервативный трансмембранный белок, участвующий в регуляции полярности эпителия, размера органов, а также развития и поддержания фоторецепторов [10], [11], [ 20] — [24].Следует отметить, что crb и мутантные сетчатки обнаруживают прикрепление соседних рабдомеров, несмотря на присутствие IRS [20], [21]. Семь из Drosophila повторов EGF Crb, 13 повторов EGF CRB1 человека и восемь повторов EGF CRB2 человека содержат сайты-мишени Rumi, что позволяет предположить, что глюкозилирование O может играть важную роль в функции Crb (рис. 3A). ). Мы провели масс-спектральный анализ пептидов, полученных из фрагмента внеклеточного домена Crb, экспрессируемого в клетках S2 Drosophila (рис. 3A, красная линия), чтобы проверить, может ли Crb быть O -глюкозилированным в Drosophila .Действительно, пептиды, содержащие предсказанные сайты в этой области, являются глюкозилированными на O (Рисунок 3B-F, Рисунок S2 и Рисунок S3). Затем мы спросили, повторяет ли потеря O -глюкозы из сайтов-мишеней Rumi в Crb фенотип прикрепления рабдомеров, наблюдаемый у мутантов rumi . Используя ранее установленную платформу [23], [25], [26], мы создали нокаутный аллель crb ( crb ^1-7-HA ) с мутациями серина в аланин во всех семи Целевые сайты Руми (рис. 3А).Животные, гомозиготные по этому аллелю или трансгетерозиготные по этому аллелю и нулевому аллелю crb ^11A22 , жизнеспособны и не проявляют каких-либо серьезных отклонений при повышении температуры от 18 ° C до 25 ° C. Более того, ПЭМ указывает на нормальную морфологию рабдомеров и образование IRS без дефектов в расположении рабдомеров у crb ^{1-7-HA / 1-7-HA} животных, выращенных при 18 ° C или 25 ° C (рис. 3G и 3H). . Эти наблюдения показывают, что отсутствие Crb O -глюкозилирования не объясняет дефекты расстояния между рабдомерами у мутантов rumi .В соответствии с этими данными, Crb, по-видимому, должным образом локализован на мембране стебля в 65% сетчатке PD rumi ^{— / —} , хотя увеличение количества точек Crb ⁺ наблюдается у выращенных мутантов rumi . при 25 ° C по сравнению с контрольными животными (рис. 3I – J ‘, стрелки). Вместе эти данные показывают, что хотя модификации O -глюкозы могут влиять на транспорт Crb, они не являются существенными для функции Crb во время эмбрионального развития мух и морфогенеза фоторецепторов.

   Рис. 3. Потеря O -глюкозы на Crb не может объяснить фенотип прикрепления рабдомера rumi ^{— / —} .

   (A) Схема человеческого CRB1, человеческого CRB2 и wt и мутантного, HA-меченного Drosophila Crb на основе полипептида Crb-PA (FlyBase ID: FBpp0083987). Синие и оранжевые прямоугольники указывают на повторы EGF, несущие консенсусные последовательности wt и мутантного Rumi соответственно. TM, трансмембранный домен. Черными кружками отмечены повторы EGF, показанные на B – F.(B – F) Данные экстрагированной ионной хроматограммы (EIC) для пептидов, содержащих консенсусный сайт O -глюкоза из Crb EGF12 (B), EGF13 (C), EGF15 (D), EGF16 (E) и EGF17 (F), полученные данные масс-спектрометрии на фрагменте Crb, обозначенном красной линией на (A). Обратите внимание на присутствие O -глюкозы (синий кружок) на всех пяти повторах EGF, некоторые из которых удлинены ксилозой (желтая звезда). Пептиды из EGF12 и EGF13 также несут O -фукозу (красный треугольник), добавленную к консенсусным сайтам O -фукозилирования, присутствующим в этих двух повторах EGF.Полные спектры и пептидные последовательности показаны на Рисунке S2 и Рисунке S3. (G, H) crb knock-in мутанты, лишенные всех сайтов-мишеней Rumi и повышенные при 18 ° C (G) или 25 ° C (H), не обнаруживают прикрепления рабдомеров. Масштабная шкала в H относится к G и H и составляет 2 мкм. (I – J ‘) Потеря Rumi не нарушает локализацию Crb в мембране стебля. Увеличение количества Crb puncta, некоторые из которых отмечены стрелками в J ‘, наблюдается в теле фоторецепторных клеток rumi ^{— / —} омматидий, повышенных при 25 ° C (J, J’) по сравнению с диким типом (I ,Я’).Актин (зеленый) используется для обозначения рабдомеров. Crb показан красным. Шкала шкалы: 5 мкм.

   https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1004795.g003

   Eys является биологически значимой мишенью для Руми во время морфогенеза рабдомеров

   Как упоминалось выше, другой белок Drosophila с множественными предсказанными сайтами-мишенями Rumi и фенотипом IRS — это Eys (Рисунок 2A и Рисунок 4A) [5], [6]. Чтобы проверить, является ли Eys биологически значимой мишенью для Rumi в контексте расстояния между рабдомерами, мы сначала выполнили масс-спектральный анализ пептидов, полученных из фрагмента Eys, несущего четыре целевых сайта Rumi, экспрессируемых в клетках S2 (рис. 4A, красная линия).До сих пор мы могли идентифицировать пептиды, соответствующие трем из этих сайтов, с помощью масс-спектрометрического анализа и идентифицировали O -глюкозу на всех трех сайтах (Рисунок 4B – D и Рисунок S4). Сайт-мишень Rumi в EGF1, по-видимому, менее эффективно глюкозилирован на O по сравнению с таковыми в других повторах Eys EGF. Тем не менее, эти данные указывают на то, что Drosophila Eys содержит несколько настоящих мишеней Rumi. Затем мы провели исследования генетического взаимодействия между rumi и eys , используя нулевой белковый аллель eys ⁷³⁴ [5].Как сообщалось ранее, потеря одной копии eys не вызывает каких-либо дефектов рабдомера (Рис. 4E) [5], [6]. Однако удаление одной копии eys на фоне rumi ^{— / —} приводит к сильному усилению фенотипа прикрепления рабдомера rumi ^{— / —} при 18 ° C (сравните рисунок 4F и 4G с рисунком 1B, 1D и 1E). В эйс ^+/− ; rumi ^{— / —} животных, несколько рабдомеров коллапсируют друг в друга в каждом омматидии, и наблюдается резкое уменьшение размера IRS (рис. 4F, 4G, 4I и 4J).Следует отметить, что карманы IRS все еще можно распознать по всем eys ^+/− ; rumi ^{— / —} омматидий (рис. 4F и 4G, звездочки), в отличие от омматидий eys ^{— / —} омматидий, у которых полностью отсутствует IRS (рис. 4H и 4J) [5]. Это генетическое взаимодействие, зависящее от дозировки, убедительно свидетельствует о том, что Руми имеет решающее значение для функции Eys, особенно когда уровни Eys ограничены.

   Рис. 4. Eys является O -глюкозилированным, а eys генетически взаимодействует с rumi .

   (A) Схема белков Eys мухи и человека. Красная линия указывает на повторы EGF, используемые для масс-спектрометрического анализа. Черными кружками отмечены повторы EGF, показанные на B – D. (B – D) данные EIC масс-спектрального анализа EGF1 (B), EGF2 (C) и EGF5 (D). Синий пик указывает на добавление O -глюкозы (синий кружок) к повтору EGF. EGF2 также модифицирован O -фукозой (красный треугольник). Руми, по-видимому, менее эффективен в O -глюкозилирующем EGF1 Eys по сравнению с другими повторами EGF при экспрессии в клетках S2.Полные спектры и пептидные последовательности показаны на рисунке S4. (E) Гетерозиготный омматидий eys с нормальным разделением рабдомеров. Шкала шкалы: 2 мкм. (F, G) eys ^+/− rumi ^{— / —} ommatidia демонстрируют резкое усиление фенотипа rumi ^{— / —} . В тяжелых случаях прикрепляются все рабдомеры (G). Карманы IRS отмечены звездочками. (H) eys null ommatidia полностью лишены IRS. (I) Процент количества отдельных рабдомеров на омматидий для различных генотипов.Для каждого генотипа использовали не менее трех животных. (J) Количественная оценка среднего индивидуального числа рабдомеров на омматидий для данных, показанных в I. Все пары значительно отличаются друг от друга (* P <0,0001).

   https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1004795.g004

   Потеря Руми приводит к снижению внеклеточного уровня Eys в зависимости от температуры

   Секреция Eys с апикальной поверхности фоторецепторных клеток на стадии середины куколки отделяет рабдомеры друг от друга и генерирует IRS [5], [6].На основании данных временной экспрессии modENCODE, доступных на FlyBase (http://flybase.org/reports/FBgn0031414.html), экспрессия eys резко увеличивается на стадии середины куколки и постепенно снижается на более поздних стадиях куколки. После начального всплеска экспрессии Eys между 50-70% PD [5] и разделения рабдомеров, Eys продолжает секретироваться в IRS, который постепенно увеличивается и принимает свой взрослый размер на поздних стадиях куколки [5], [19]. Учитывая повышенную степень прикрепления рабдомеров и серьезное уменьшение размера IRS у взрослых животных, одновременно лишенных rumi и одной копии eys , мы исследовали, влияет ли потеря Rumi на уровни Eys в IRS.Сначала мы сравнили экспрессию Eys на ранних стадиях развития IRS между rumi ^{— / —} и контрольными куколками, выращенными при 18 ° C. При 55% PD рабдомеры контрольных животных отделены друг от друга тонкой, но непрерывной IRS, заполненной Eys, и только низкие уровни Eys могут быть обнаружены в теле фоторецепторных клеток (рис. 5A и 5A ‘) [5]. Напротив, rumi ^{— / —} ommatidia почти всегда обнаруживают некоторую степень прикрепления рабдомеров и сниженный и прерывистый паттерн экспрессии Eys в IRS (Figure 5B and 5B ‘).У большинства исследованных омматидий rumi ^{— / —} пониженные уровни Eys в IRS сопровождаются повышенными уровнями Eys в телах фоторецепторных клеток (рис. 5B и 5B ‘). Количественная оценка общей интенсивности пикселей Eys при 55% PD у животных, выращенных при 18 ° C, показывает, что у омматидий дикого типа 87,1 ± 2,0% от общего количества Eys находится в IRS, а остальное — в теле фоторецепторных клеток. Однако наблюдается статистически значимое снижение процента Eys, обнаруженных в IRS у омматидий rumi ^{— / —} (63.6 ± 6,5%, P = 0,01). Эти данные показывают, что на ранних стадиях формирования IRS значительное количество Eys остается внутри фоторецепторных клеток у мутантов rumi , в отличие от животных дикого типа, у которых большая часть Eys эффективно секретируется в IRS.

   Рис. 5. Потеря Rumi приводит к внутриклеточному накоплению и снижению уровней IRS Eys в зависимости от температуры на стадии середины куколки.

   (A – G ‘) Конфокальные микрофотографии, каждая из которых показывает один омматидий указанных генотипов.Фаллоидин (зеленый) обозначает актин и сосредоточен в рабдомерах; Eys показан красным. Пунктирными линиями отмечен контур одного тела фоторецепторной клетки на каждой микрофотографии. Масштабная линейка в A относится к A – G ‘и составляет 5 мкм. (A, A ‘) Омматидий дикого типа при 55% PD, повышенном при 18 ° C. Обратите внимание, что Eys в основном локализован для IRS. (B, B ‘) A rumi ^{— / —} омматидий при 55% PD, повышенном при 18 ° C. Обратите внимание на снижение уровня Eys в IRS и его накопление в теле клетки. (C, C ‘) Омматидий дикого типа при 95% PD, повышенном при 18 ° C.(D, D ′) A rumi ^{— / —} омматидий при 95% PD, повышенном при 18 ° C. Обратите внимание на повышенное количество Eys в IRS на этой стадии и исчезновение Eys из тел фоторецепторных клеток по сравнению с B. Белыми стрелками отмечены точки прикрепления рабдомеров и промежутки в Eys. (E, E ‘) Одиночный омматидий животного дикого типа при 55% PD сместился до 30 ° C во время образования IRS. (F – G ‘) Ommatidia из руми ^{— / —} животных при 55% PD, сдвинутом на 30 ° C во время формирования IRS, демонстрируют сильное накопление Eys в теле клетки с полным отсутствием Eys в IRS (F , F ′) или тонкой линией Eys в IRS (G, G ′).(H, I) Электронные микрофотографии, показывающие омматидии дикого типа (H) и rumi ^{— / —} (I) от животных с 75% PD, сдвинулись до 30 ° C во время образования IRS. Масштабная линейка в I относится к H и I и составляет 2 мкм.

   https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1004795.g005

   Как показано выше, мутанты rumi , выращенные при 18 ° C, демонстрируют прикрепление рабдомеров и значительно уменьшенный размер IRS на стадии середины куколки (рис. 1K). ). Однако у взрослых особей rumi ^{— / —} , даже несмотря на то, что прикрепления рабдомеров сохраняются, IRS в центре омматидий выглядит так же, как и у контрольных омматидий (рис. 1A – E), что позволяет предположить, что достаточное количество Eys секретируется позже стадии куколки для расширения IRS.Чтобы проверить это представление, мы исследовали экспрессию Eys у животных дикого типа и rumi нулевых животных при 95% PD. У животных дикого типа Eys непрерывно заполняет IRS и не может быть замечен в теле клетки (рис. 5C – C ‘). У мутантов rumi Eys правильно локализован в IRS на уровнях, аналогичных обнаруженным в IRS дикого типа, и не виден в теле клетки (рис. 5D и 5D ‘). Однако множественные пробелы в домене экспрессии Eys видны в IRS, совпадающие с прикреплениями рабдомеров (Рис. 5D и 5D ‘, белые стрелки).Эти данные подтверждают, что прикрепления рабдомеров у мутантов rumi являются результатом пониженных уровней Eys в IRS в критический период во время стадии середины куколки и что эти прикрепления не разрешаются позже в развитии куколки, несмотря на продолжающуюся секрецию Eys.

   Поскольку потеря передачи сигналов Notch у мутантов rumi чувствительна к температуре [12], [14], [15], мы затем исследовали, ухудшается ли дефект IRS, наблюдаемый у животных rumi при более высоких температурах.Чтобы избежать дефектов летальности личинок и дефектов спецификации фоторецепторов у мутантов rumi при 30 ° C, мы держали мутантных животных rumi и контрольных животных при 18 ° C до конца стадии третьего возраста и переводили их на 30 ° C в нулевые часы. после образования пупария (APF), так что они содержались при высокой температуре на стадии середины куколки, когда начинается экспрессия eys [5]. Однако эти животные погибли к середине куколки, что исключает изучение секреции Eys и формирования IRS. Поэтому мы изменили наш режим смены температуры, переведя руми ^{— / —} и контрольных животных на 25 ° C при нулевой температуре APF, переместили их на 30 ° C при 24-часовом APF и держали их при этой температуре до 55% — 75% развития куколок, когда мы вскрыли их для окрашивания или ПЭМ.Образцы окрашивания фаллоидином и Eys у контрольных животных были похожи на образцы, полученные при 18 ° C (рис. 5E и 5E ‘). Напротив, у мутантов rumi либо отсутствовал Eys в IRS (фиг. 5F и 5F ‘), либо имелись небольшие участки, содержащие Eys (фиг. 5G и 5G’). Большинство мутантных омматидий rumi показали высокие уровни Eys в фоторецепторных клетках (рис. 5F – G ‘). ТЕА на rumi ^{— / —} животных, выращенных в вышеупомянутых условиях, показала множественные участки прикрепления рабдомеров и небольшой IRS при 75% PD по сравнению с контрольными животными, выращенными в тех же условиях (Фиг.5H и 5I).Эти наблюдения показывают, что у мутантов rumi , выращенных при более высоких температурах, более высокая фракция Eys остается внутри клетки, а уровень Eys в IRS дополнительно снижается.

   Чтобы проверить, накапливается ли Eys в определенном субклеточном компартменте в мутантных фоторецепторных клетках rumi , мы провели исследования совместной локализации между Eys и маркерами ER (рис. 6A – A ″), Гольджи (рис. 6B – B ″), рециркулирующей эндосомой (рис. 6C – C ″), а поздняя эндосома (рис. 6D – D ″) у rumi нулевых животных сместилась до 25 ° C при нулевом APF и позже до 30 ° C при 24-часовом APF, как объяснено выше.Eys транспортировался во все исследованные клеточные компартменты, как показано периодической совместной локализацией с каждым маркером (рис. 6A – D ″, белые стрелки), что указывает на то, что трафик Eys не блокируется ни на одном этапе пути секреции, а, вероятно, замедляется через секреторный путь, заставляющий его накапливаться в теле клетки по мере продвижения к мембране.

   Рис. 6. Eys не накапливается в одном субклеточном компартменте в фоторецепторах rumi ^{— / —} , поднятых при 30 ° C.

   Конфокальные микрофотографии 75% PD rumi ^{— / —} омматидий с меткой Eys и маркером ER Boca (A – A ″), маркером Golgi Lava lamp (B – B ″), рециркулирующим эндосомным маркером Rab11 ( C – C ″) и поздний эндосомальный маркер Rab7 (D – D ″). Белые стрелки отмечают совместную локализацию между Eys и соответствующим субклеточным компартментом. Eys показывает только случайную совместную локализацию с каждым маркером, что убедительно свидетельствует о том, что Eys не накапливается в одном отделении.

   https: // doi.org / 10.1371 / journal.pgen.1004795.g006

   Ухудшение дефекта IRS и дальнейшее снижение внеклеточных уровней Eys у мутантных животных rumi , выращенных при более высокой температуре, предполагают, что в отсутствие Rumi Eys неправильно свернут. Чтобы оценить влияние потери Rumi на уровни белка Eys при низких и высоких температурах, мы выполнили вестерн-блоттинг экстрактов с головы 80% PD животных дикого типа и rumi ^{— / —} животных. При выращивании при 18 ° C в течение всего развития куколки дикого типа и руми ^{— / —} не показали значительных различий в уровне Eys (Рисунок 7A, левая панель, P = 0.57). Однако, когда животных выращивали при 18 ° C до средней стадии куколки и переводили на 30 ° C во время формирования IRS, наблюдалось значительное снижение уровня Eys в rumi ^{— / —} голов куколки (рис. 7A. , правая панель, P <0,05). Эти данные подтверждают мнение о том, что потеря Руми снижает способность Eys правильно сворачиваться и секретироваться с нормальной скоростью. Данные также предполагают, что при более высоких температурах неправильная укладка приводит к деградации Eys и ухудшению дефектов IRS у мутантных животных rumi .

   Рис. 7. rumi ^{— / —} животных демонстрируют температурно-зависимое снижение уровней Eys и чувствительное к дозировке генетическое взаимодействие с шапероном ER.

   (A) Вестерн-блоты, показывающие уровни Eys в руми ^{— / —} и yw голов, выращенных при 18 ° C (слева) и 30 ° C (справа). Наблюдается статистически значимое снижение уровней Eys в головах rumi ^{— / —} , приподнятых при 30 ° C ( P <0,05; нижняя панель).(B, C) Hsc70-3 ^+/- ; rumi ^{— / —} ommatidia демонстрируют усиление фенотипа rumi ^{— / —} . (B) Электронная микрофотография, показывающая один омматидий из Hsc70-3 ^+/- ; руми ^+/− контрольное животное. (C) Электронная микрофотография, показывающая Hsc70-3 ^+/- ; руми ^{— / —} омматидий. Часто прикрепляются все рабдомеры, кроме одной. (D) Количественная оценка среднего индивидуального числа рабдомеров на омматидий для указанных генотипов.* P <0,0001. (E) Уровни Hsc70-3, который индуцируется при UPR, не изменяется между rumi ^{— / —} и y w животных, выращенных при разных температурах. Верхняя панель: вестерн-блоттинг, показывающий уровни Hsc70-3 и контроль загрузки тубулина. Нижняя панель: соотношение уровней Hsc70-3 / тубулина, которое не меняется между генотипами. NS, не имеет значения.

   https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1004795.g007

   Если прикрепления рабдомеров, наблюдаемые у мутантов rumi , являются результатом неправильного сворачивания Eys, снижение уровня белков-шаперонов может усилить этот фенотип.Чтобы проверить эту гипотезу, мы исследовали, влияет ли удаление одной копии шаперона ER Hsc70-3 (BiP) на прикрепление рабдомера у животных rumi ^{— / —} . Как показано на Фигуре 7B, животные, дважды гетерозиготные по летальному элементу P , вставленному в кодирующую область Hsc70-3 ( Hsc70-3 ^G0102 ) и rumi , не обнаруживают прикрепления рабдомера. Однако Hsc70-3 ^{G0102 / +} ; rumi ^{— / —} животных, выращенных при 18 ° C, демонстрируют усиление фенотипа прикрепления рабдомеров, наблюдаемое у rumi ^{— / —} животных, выращенных при той же температуре (Рисунок 7C; сравните с Рисунок 1).Среднее количество отдельных рабдомеров в Hsc70-3 ^{G0102 / +} ; rumi ^{— / —} животных значительно отличается от rumi ^{— / —} животных (рисунок 7D, 2,85 ± 0,11 против 4,11 ± 0,08, P <0,0001). Это наблюдение дополнительно подтверждает вывод, что Eys неправильно уложен у мутантов rumi . Затем мы спросили, вызывает ли потеря Руми развернутый белковый ответ (UPR) в глазу куколки. Одним из отличительных признаков UPR является индукция шаперонов, включая Hsc70-3 [27].Вестерн-блоттинг с использованием антитела против Hsc70-3 не показал увеличения уровня экспрессии Hsc70-3 у мутантов rumi , повышенного при 18 ° C или 30 ° C, по сравнению с контрольными животными (фиг. 7E). Это указывает на то, что UPR не индуцируется в глазах куколки при потере Rumi, что согласуется с предыдущим сообщением об отсутствии индукции UPR у клонов rumi ^{— / —} в имагинальных дисках крыльев, выращенных при 28 ° C, несмотря на накопление Белок Notch [12].

   Мутации в сайтах Eys

   O -глюкозилирования приводят к его внутриклеточному накоплению

   Если потеря активности Poglut приводит к внутриклеточному накоплению Eys на стадии середины куколки, мутация сайтов-мишеней Rumi на Eys также должна влиять на его доставку.Чтобы проверить это, мы сгенерировали трансгенов UAS-attB , способных сверхэкспрессировать Eys дикого типа (Eys ^wt ) или Eys с мутациями серина в аланин в четырех (Eys ^1-4 ) или во всех пяти мишенях Rumi. сайтов (Eys ^1-5 ) (Рисунок 8A). Чтобы свести к минимуму вариабельность экспрессии, связанную со случайной вставкой трансгенов, мы использовали трансгенез ФС31 и интегрировали все три конструкции в один и тот же сайт стыковки ( VK31 ) в геноме мух [28], [29]. Мы использовали GMR-GAL4 для сверхэкспрессии Eys дикого типа и мутантных Eys в развивающихся фоторецепторах и держали животных при 18 ° C, чтобы избежать очень высоких уровней экспрессии трансгена, управляемого GAL4, при высоких температурах.У животных со сверхэкспрессией Eys дикого типа IRS увеличивается, и большая часть Eys находится внутри IRS, хотя низкие уровни Eys наблюдаются в фоторецепторных клетках (рис. 8B – C ‘). Избыточная экспрессия Eys ^1-4 и Eys ^1-5 также увеличивает IRS (Рисунок 8D-E ‘, сравните с Фиг.5). Однако, в отличие от белка дикого типа, O -глюкозные мутантные версии белка Eys накапливаются в фоторецепторных клетках (рис. 8D – E ‘, белые стрелки). Эти данные подтверждают роль остатков O -глюкозы в правильном сворачивании и перемещении Eys.

   Рис. 8. Потеря O -глюкозы на Eys приводит к ее внутриклеточному накоплению.

   (A) Схема Eys ^wt , Eys ^1-4 , в котором мутированы четыре из пяти сайтов-мишеней Rumi, и Eys ^1-5 , в котором мутированы все сайты-мишени Rumi. (B – E ‘) Сверхэкспрессия Eys ^1-5 (D, D’) и Eys ^1-4 (E, E ‘), но не Eys ^wt (B – C’), приводит к внутриклеточному Скопление глаз (стрелки). Использовали драйвер GMR-GAL4 , и всех животных выращивали при 18 ° C.Обратите внимание, что GMR> eys ^wt животное, показанное на (B, B ‘), и GMR> eys ^1-5 животное (D, D’) моложе, чем GMR> eys ^wt животных, показанных на (C, C ‘), и GMR> eys ^1-4 животных (E, E’). Шкала шкалы: 5 мкм.

   https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1004795.g008

   Обсуждение

   Ранее мы показали, что внеклеточные домены Drosophila и Notch белков млекопитающих эффективно O -глюкозилированы, и предоставили убедительные доказательства того, что Rumi / POGLUT1 является единственным белком O -глюкозилтрансферазы, способным добавлять O -глюкоза к повторам EGF у животных [12], [13], [16], [18], [30].Представленные здесь данные показывают, что Drosophila, Crb и Eys также содержат O -глюкозных остатков, однако влияние потери Rumi и потери O -глюкозы из этих трех белков-мишеней, которые несут наибольшее количество мишеней Rumi. сайтов среди всех белков Drosophila , не является эквивалентным. Потеря Rumi и мутации в сайтах-мишенях Rumi в геномном трансгене Notch приводят к зависимой от температуры потере передачи сигналов Notch [12], [14], что указывает на то, что белок Notch становится чувствительным к изменениям температуры в отсутствие O -глюкоза.Хотя фенотип Notch с потерей функции у мутантов rumi , выращенных при 18 ° C, является слабым и ограничен определенными контекстами, выращивание животных, гомозиготных по rumi или несущих митотические клоны rumi при 28–30 ° C, фенокопии Notch -null фенотипы [12], [15], [17], что указывает на то, что O -глюкоза необходима для функции Drosophila Notch при ограничительной температуре. На функциональном уровне потеря Rumi влияет на Eys аналогичным образом, с умеренным фенотипом прикрепления рабдомеров при 18 ° C, который становится более серьезным, когда rumi животных выращивают при 30 ° C во время формирования IRS.Однако даже при выращивании при 30 ° C rumi не фенокопирует фенотип eys -null в глазу, поскольку рабдомеры обнаруживают некоторую степень разделения на стадии середины куколки. На функцию Crb, напротив, не оказывает значительного влияния потеря O -глюкозы, поскольку мухи, гомозиготные по мутантному аллелю crb , который не содержит интактных консенсусных последовательностей Руми, являются жизнеспособными и фертильными и не являются фертильными. проявляют какие-либо очевидные фенотипы в морфогенезе рабдомеров.Дивергентные эффекты O -глюкозы на функцию этих белков, по-видимому, не коррелируют с количеством сайтов-мишеней Rumi или общей структурой этих белков, поскольку Notch и Crb являются трансмембранными белками, но секретируются Eys, Crb и Оба Eys имеют комбинацию повторов EGF и доменов Laminin G, но Notch не имеет доменов Laminin G, а Crb имеет большее количество сайтов-мишеней Rumi (семь) по сравнению с Eys (пять). Таким образом, наши данные показывают, что, хотя мотив C ¹ XSX (P / A) C ² является высокопрогнозируемым для добавления O -глюкозы к EGF-повторам белков Drosophila , функциональная важность O -глюкоза зависит от дополнительных параметров, помимо количества O -глюкозных сайтов и общей доменной структуры данного целевого белка.

   У мутантных омматидий rumi значительное количество Eys остается внутри фоторецепторных клеток, в то время как внеклеточные уровни Eys в IRS снижаются. При ограничительной температуре эти фенотипы усиливаются, и общий уровень Eys в головах мутантов rumi значительно снижается. Более того, удаление одной копии важного ER шаперона усиливает фенотип прикрепления рабдомеров у мутантов rumi . Наконец, животные, гомозиготные по каталитически неактивному аллелю rumi ⁷⁹ , также обнаруживают прикрепление рабдомеров, и мутация сайтов O -глюкозы Eys приводит к его внутриклеточному накоплению.Вместе эти наблюдения убедительно подтверждают, что потеря O -глюкозилирования приводит к неправильной укладке Eys и снижению его внеклеточных уровней. Напротив, несмотря на почти полную потерю передачи сигналов Notch в клонах rumi , выращенных при 28-30 ° C, поверхностная экспрессия Notch не снижается при потере Rumi; действительно, Notch накапливается внутри и на поверхности мутантных эпителиальных клеток rumi , повышенных при рестриктивной температуре [12]. Более того, клеточные и генетические эксперименты предполагают, что в отсутствие Rumi Notch способен связывать лиганды на поверхности клетки, но не может правильно расщепляться с помощью металлопротеиназы ADAM10 Kuzbanian [12], [14].Следовательно, хотя эти сообщения не могут исключить избыточную роль O -глюкозы в обеспечении экспрессии Notch на клеточной поверхности, они указывают, что O -глюкоза необходима для передачи сигналов Notch независимо от ее экзоцитарного транспорта. Тем не менее, зависимое от температуры усиление потери передачи сигналов Notch и накопления Notch у мутантов rumi [12], [14] указывает на то, что на укладку Notch также может влиять потеря O -глюкозы.Аналогичным образом, увеличение количества точек Crb ⁺ , наблюдаемое в фоторецепторах rumi ^{— / —} , повышенных при 25 ° C, предполагает, что, хотя функция Drosophila Crb не зависит от O -глюкозилирования, потеря O -глюкоза влияет на торговлю Crb. Следовательно, хотя мы не можем исключить, что O -глюкозилирование влияет на каждую из этих мишеней по-разному на молекулярном и клеточном биологических уровнях, мы предпочитаем сценарий, в котором на сворачивание всех трех мишеней влияет потеря O -глюкозы.В этом сценарии степень функциональных дефектов, наблюдаемых для каждой мишени и клеточного компартмента, в котором наблюдается дефект, варьируется в зависимости от степени неправильного свертывания, чувствительности целевого белка к нехватке O -глюкозы и клеточного контекста, в котором цель действует. Интересно отметить, что только Rumi / POGLUT1 глюкозилирует правильно свернутые EGF-повторы in vitro [31], указывая тем самым, что Rumi / POGLUT1 может оказывать свое влияние на сворачивание на уровне индивидуальных повторов EGF.

   Анализ разделения рабдомеров и размера IRS у средней куколки и поздней куколки / взрослой особи rumi ^{— / —} животных, выращенных при 18 ° C, предполагает две разные во времени стадии функции Eys во время формирования IRS. На ранних стадиях формирования IRS некоторые из рабдомеров в каждом омматидии не могут отделиться друг от друга, и мутантный IRS значительно меньше контрольного IRS. На поздних стадиях куколки уровень Eys в IRS омматидий rumi ^{— / —} сравним с таковым в контрольных омматидиях, что согласуется с более или менее нормальным размером IRS, наблюдаемым у взрослых омматидий rumi .Тем не менее, прикрепления рабдомеров не устранены. Эти наблюдения предполагают, что Eys генерирует IRS в два этапа. При ~ 45-55% PD секреция Eys необходима для разрыва прикреплений между рабдомерами в каждом омматидии (стадия 1), вероятно, противодействуя силам адгезии, опосредованным Chaoptin [6]. Разделение рабдомеров, в свою очередь, создает каналы между мембранами стебля, где секретируется Eys [5], и центральной IRS, и тем самым позволяет Eys увеличивать размер IRS после разделения рабдомеров (стадия 2).Мы предполагаем, что у мутантов rumi белок Eys не может правильно сворачиваться и в результате значительная часть Eys остается внутри клетки, а не секретируется во внеклеточное пространство. Следовательно, на стадии середины куколки Эйс не может полностью отделить рабдомеры друг от друга. После прохождения критического временного окна между 45-55% PD (этап 1) продолжающаяся секреция Eys на этапе 2 (расширение IRS) больше не может разделять рабдомеры. Однако, поскольку в каждом омматидии rumi некоторые рабдомеры отделены друг от друга, Eys может достигать центральной IRS и может постепенно увеличивать размер IRS.Эта двухступенчатая модель разделения рабдомеров и экспансии IRS дополнительно подтверждается наблюдением, что избыточная экспрессия Eys в eys нулевом фоне после 65% PD не может разделить рабдомеры [6].

   Отсутствие аномалий фоторецепторов у мутантов crb без интактных сайтов-мишеней Rumi было несколько неожиданным, учитывая, что Crb имеет второе по величине количество мотивов глюкозилирования O во всех белках мух и что несколько повторов EGF в человеческих CRB1 и CRB2 содержат консенсусная последовательность Руми.Наши данные показывают, что O -глюкозилирование Crb не требуется для жизнеспособности, фертильности и морфогенеза фоторецепторов у мух, по крайней мере, в лабораторных условиях. Внеклеточный домен Crb является незаменимым для правильной апикально-базальной полярности у эмбрионов [32], но он необходим в других контекстах, таких как формирование мембраны стебля [11], регулирование размера головы [24], предотвращение индуцированной светом дегенерации фоторецепторов. [21] и инвагинация плакоды слюнной железы у эмбрионов [33].Хотя формирование мембраны стебля не нарушается при мутации всех сайтов Crb O -глюкозы, остается определить, требуется ли O -глюкозилирование Crb для регуляции других процессов, регулируемых внеклеточным доменом Crb, и действительно ли O -глюкозилирование белков CRB млекопитающих необходимо для их функции.

   Хотя ряд видов млекопитающих, включая мышей, крыс, морских свинок и овец, потеряли Eys в процессе эволюции [34], у людей есть гомолог Eys (EYS), который демонстрирует общую организацию белкового домена, аналогичную Eys мух (рис. 4). [35].Трансгенная экспрессия человеческого EYS на нулевом фоне Drosophila eys продуцирует карманы IRS, предположительно в месте секреции, но не в состоянии спасти фенотип прикрепления рабдомеров [9]. Однако, когда человеческий EYS коэкспрессируется на eys ^{— / —} животных с человеческим гомологом Drosophila Prom, называемым PROM1, некоторые рабдомеры отделяются от своих соседей [9]. Т.к. связывание между Drosophila Eys и Prom важно для формирования IRS [6], эти эксперименты по спасению подчеркивают эволюционное сохранение взаимодействия Eys-Prom в зрительной системе.Следует отметить, что мутации в человеческих EYS и PROM1 вызывают несколько форм дегенерации сетчатки, включая аутосомно-рецессивный пигментный ретинит, палочковидные дистрофии и колбочковидные дистрофии [34] — [43]. EYS человека содержит семь сайтов-мишеней для O -глюкозилирования, 4–5 из которых сгруппированы аналогично сайтам-мишеням Rumi в EGF1-5 Drosophila Eys. Следовательно, O -глюкозилирование может играть важную роль в функции человеческого EYS.

   Материалы и методы

   Drosophila штаммов и генетика

   В данном исследовании использовались следующие штаммы: 1) Canton-S , 2) y w , 3) w; noc ^Sco / CyO; TM3, Sb ¹ / TM6, Tb ¹ , 4) y w; D / TM6, Tb ¹ , 5) N ^55e11 / FM7c , 6) y ¹ w ^67c23 P {Crey} 1b; D ^* / TM3, Sb ¹ , 7) y ¹ M {vas-int.Dm} ZH-2A w ^* ; VK31 , 8) y ¹ M {vas-int.Dm} ZH-2A w ^* ; VK22 , 9) w ⁶⁷ c ²³ P {lacW} Hsc70-3 ^G0102 / FM7c , 10) GMR-GAL4 (на 2) (Bloomington Drosophila Stock Center), 11) GMR-GAL4 (на 3) [44], 12) eys ⁷³⁴ [5], 13) P {rumi ^gt-FLAG } ( rumi rescue transgene), 14) yw ; FRT82B руми ⁷⁹ / TM6, Tb ¹ , 15) y w; FRT82B руми ^Δ26 / TM6, Tb ¹ [12], 16) y w; PBac {N ^gt-4-35 } attVK22 [14], 17) eys ⁷³⁴ / CyO; FRT82B руми ^Δ26 / TM6, Tb ¹ , 18) y w; crb ^1-7 :: HA-A ( crb ^1-7-HA ), 19) UAS-attB-eys ^wt -VK31 , 20) UAS-attB-eys ^{1 -4} -VK31 , 21) UAS-attB-eys ^1-5 -VK31 , 22) UAS-attB-rumi ^wt-FLAG -VK22 , 23) UAS-attB-rumi ^79-FLAG -VK22 (данное исследование), 24) yw; crb ^wt :: HA-A ( crb ^wt-HA ) [25], 25) crb ^11A22 / TM6, Tb ¹ [10].

   Все скрещивания мутантов rumi выращивали при 18 ° C, чтобы минимизировать температурно-зависимые дефекты передачи сигналов Notch, если не указано иное. Для получения N ^55e11 / Y; PBac {N ^gt-4-35 } attVK22 / + животных, N ^55e11 / FM7c самок были скрещены до y w / Y; Самцы PBac {N ^gt-4-35 } attVK22 и мужское потомство были отобраны на основании отсутствия фенотипа глаза FM7 bar.

   Для удаления одной копии Hsc70-3 в руми ^{— / —} животных, w ⁶⁷ c ²³ P {lacW} Hsc70-3 ^G0102 / FM7c Самки были сначала скрещены с yw; FRT82B руми ^Δ26 / TM6, Tb ¹ самцов.Модель w ⁶⁷ c ²³ P {lacW} Hsc70-3 ^G0102 / y w; FRT82B rumi ^Δ26 / + потомков-самок от этого скрещивания были подвергнуты обратному скрещиванию с получением y w; FRT82B руми ^Δ26 / TM6, Tb ¹ самцов. w ⁶⁷ c ²³ P {lacW} Hsc70-3 ^G0102 / y w; FRT82B rumi ^Δ26 / FRT82B rumi ^Δ26 Потомство было выбрано на основе цвета глаз из аллеля Hsc70-3 и мутантного фенотипа щетинок rumi [14] и использовалось для анализа ТЕМ.

   O -Картирование сайтов глюкозы на Drosophila фрагментов Crb и Eys, экспрессируемых в клетках S2

   Была синтезирована конструкция, кодирующая EGF1-5 из Drosophila Eys (несущая четыре из пяти сайтов-мишеней Rumi Eys) (Genewiz, Inc.). EGF12-17 из Drosophila Crb (несущий пять из семи сайтов-мишеней Rumi для Crb) амплифицировали с использованием регион-специфичных праймеров из геномной ДНК, выделенной из мух, несущих трансген UAS-crb-full-length [20].Геномную ДНК получали с использованием набора для очистки ДНК от Promega. Фрагмент Eys был клонирован в рамке считывания с N-концевым сигнальным пептидом из Drosophila Ацетилхолинэстеразы и C-концевыми метками V5 и 6x-гистидина в векторе pMT / V5-HisB-ACE [12]. Фрагмент Crb был клонирован в вектор pMT / BiP / 3xFLAG с использованием EcoRI и XbaI [45]. Eys-EGF1-5-V5-His и Crb-EGF12-17-3xFLAG были экспрессированы в клетках Drosophila S2, очищенных от среды с помощью никелевой колонки или анти-FLAG смолы, соответственно, восстановленных и алкилированных, и подвергнутых воздействию в геле. протеаза переваривает, как описано [46], [47] с небольшими модификациями. O -Гликопептиды, модифицированные глюкозой, были идентифицированы по нейтральной потере гликанов во время диссоциации, вызванной столкновением (CID), с использованием нано-LC-MS / MS, как описано [13].

   Рассечение, окрашивание, обработка, получение изображений и количественная оценка

   Для вскрытия при развитии куколки 55% и 65% отбирали животных на стадии белой предкуколки и выдерживали 4,5 дня (55%) и 5,5 дня (65%) при 18 ° C. Для животных, выращиваемых при более высоких температурах, белые предкуколки помещали при 25 ° C в нулевые часы APF на 1 день, а затем помещали при 30 ° C до 55% или 75% PD для рассечения.Кожух куколки был удален, а головы проколоты для правильной фиксации. Роговицы удаляли из глаз в PBS. Ткани фиксировали с использованием 4% формальдегида в течение 30-40 минут, а затем промывали 0,3-0,5% Triton X-100 в PBS. Блокирование и инкубацию антител проводили в PBS, содержащем 0,5% Triton X-100 и 5% сыворотки (ослиной или козьей). Были использованы следующие антитела: мышиные анти-Eys (21A6) 1-250 и мышиные анти-ELAV (9F8A9) 1-200 (Developmental Studies Hybridoma Bank), анти-Eys 1-1000 морских свинок [5], анти-Eys 1-1000 морских свинок. Boca 1–1000 [48], крысиные анти-Crb 1–500 [11], кроличьи анти-лавовые лампы 1–2000 [49], кроличьи анти-Rab11 1–1000 [50], кроличьи анти-Rab7 1–100 [ 51], мышиные анти-Rab11 1∶100 (BD Biosciences), анти-Senseless 1∶2000 морских свинок [52], козьи антимышиные-Cy3 1∶500, козьи антимышиные-Cy5 1∶500, ослиные анти- мышь-Dylight649 1-500, ослиные антимышиные-Cy3 1-500, ослиные анти-кроличьи-Cy3 1-500, ослиные анти-морские свинки-Dylight649 1-500 (Jackson ImmunoResearch Laboratories).Конъюгированный с фаллоидином Alexa488 1-500 (Life Technologies) использовали для визуализации рабдомеров. Конфокальные изображения были получены либо с помощью микроскопа Leica TCS-SP5 с маслом HCX-PL-APO 63x, объективом NA 1,25 и объектива HCX-PL-APO 20x, 0,7 NA с конфокальным детектором PMT SP, либо микроскопа TCS-SP8. с глицерином HC-PL-APO 63x, объективом NA 1.3 и детектором HyD SP GaAsp. Все изображения были получены с использованием программного обеспечения Leica LAS-SP. Для обработки использовались Amira 5.2.2 и Adobe Photoshop CS4, а рисунки собирались в Adobe Illustrator CS5.1.

   Чтобы количественно определить размер IRS, электронные микрофотографии были открыты с использованием программного обеспечения для обработки изображений с открытым исходным кодом «Fiji is just ImageJ». Масштаб был установлен путем отслеживания масштабной линейки на изображении с помощью инструмента «Линия» и функции «Установить масштаб». IRS отслеживали с помощью инструмента выделения от руки, а площадь измеряли с помощью функции «измерения».

   Для количественной оценки общей интенсивности пикселей использовалась программа обработки изображений Amira 5.2.2. Был обрезан один омматидий, что делалось дважды для каждого изображения, чтобы получить данные от 2 разных омматидий на животное.Желаемый канал для количественной оценки был помечен функцией «поле метки», и был открыт «редактор сегментации». IRS отслеживался с помощью инструмента от руки лассо, помещенного в отдельный «материал», а остальные пиксели в канале были выбраны с помощью инструмента порогового значения и помещены в отдельный «материал». Одинаковый порог использовался для всех омматидий. В модуле «пул объектов» общие интенсивности пикселей для IRS и остальной части омматидия были получены с использованием опции «статистика материалов».

   Вестерн-блоттинг

   белков экстрагировали лизированием головок в буфере RIPA (Boston BioProducts), содержащем растворенную таблетку коктейля ингибитора протеазы (Roche Diagnostics). На каждую голову мухи использовали примерно 10 мкл буфера RIPA. Были использованы следующие антитела: анти-Hsc70-3 1–5000 морской свинки [27], анти-Eys 1–10000 морской свинки [5], мышиные анти-FLAG 1–1000 (M2, Sigma-Aldrich), мышиные анти- Тубулин 1–1000 (Santa Cruz Biotech), козий антимышиный HRP 1–5000 и козий антимышиный HRP 1–5000 (Jackson ImmunoResearch Laboratories).Вестерн-блоттинг был разработан с использованием субстратов для вестерн-блоттинга Pierce ECL (Thermo Scientific). Полосы были обнаружены и количественно определены с использованием системы ImageQuant LAS 4000 и программного обеспечения ImageQuant TL, соответственно, от GE Healthcare. Для каждого эксперимента выполняли не менее двух независимых иммуноблотов.

   Просвечивающая электронная микроскопия

   Для обработки мух с помощью просвечивающей электронной микроскопии головы препарировали и фиксировали в течение ночи при 4 ° C в параформальдегиде, глутаральдегиде и какодиловой кислоте и обрабатывали, как описано ранее [53].Вкратце, после фиксации головки фиксировали 1-2% OsO ₄ , дегидратировали этанолом и оксидом пропилена, а затем заливали смолой Embed-812. Тонкие срезы (толщиной ~ 50 нм) окрашивали 1-2% уранилацетатом в качестве отрицательного окрашивания, а затем окрашивали цитратом свинца Рейнольдса. Изображения были получены с использованием трех различных просвечивающих электронных микроскопов: 1) Hitachi H-7500 с камерой Gatan US100: изображения были получены с использованием программного обеспечения Digital Micrograph, v1.82.366; 2) JEOL 1230 с камерой Gatan Ultrascan 1000: изображения получали с помощью программного обеспечения Gatan Digital Micrograph; 3) JEOL JEM 1010 с камерой AMT XR-16: изображения были получены с использованием AMT Image Capture Engine V602.Все изображения были обработаны в Adobe Photoshop CS4, а рисунки собраны в Adobe Illustrator CS5.1.

   Получение нокаутных и трансгенных животных

   Для создания crb ^1-7 :: HA-A нокаут-аллеля ( crb ^1-7-HA ) была использована мутантная линия-основатель crb , в которой 10 kb из Локус crb , несущий большую часть кодирующей области, заменен сайтом attP и сайтом loxP [25].Для введения мутаций серина в аланин во все семь сайтов-мишеней Rumi Crb в pGE-attB ^GMR -crb ^wt :: HA-A нацеленный вектор [25] для сгенерируйте целевую конструкцию pGE-attB ^GMR -crb ^1-7 :: HA-A . ФС31-опосредованную интеграцию использовали для введения фрагмента crb ^1-7 :: HA-A в локус crb мутантной линии-основателя crb .Трансген, экспрессирующий Cre [54], был использован для удаления GMR-hsp :: white и остальных векторных последовательностей из нокаут-аллеля и для получения аллеля white ^— crb ^1-7 :: HA-A , использованный в нашем исследовании. Геномная ПЦР с несколькими парами праймеров в области была выполнена для подтверждения правильной интеграции и Cre-опосредованной рекомбинации, как описано ранее [25]. Последовательности праймеров доступны по запросу.

   Для создания трансгенов eys дикого типа и мутантных трансгенов eys полной длины извлекали из конструкции pUAST-eys [6] с помощью рестрикционного расщепления и клонировали в вектор pUASTattB [28], в результате чего получали в pUASTattB-eys ^wt .Для создания мутантных трансгенов eys был синтезирован фрагмент кДНК длиной 603 п.н., содержащий EGF1-5 Eys с мутациями из серина в аланин в четырех сайтах-мишенях в этой области (EGF1-3 и EGF5) (Genewiz, Inc. ). Область EGF1-5 дикого типа в конструкции pUASTattB-eys ^wt была заменена синтезированной мутантной версией с использованием двух раундов ПЦР с перекрытием концов [55] с тремя перекрывающимися фрагментами. Полученный в результате фрагмент размером 1,2 т.п.н., содержащий первые четыре мутантных сайта-мишени Rumi, был помещен в pUASTattB-eys ^wt с использованием рестрикционных ферментов BglII и SacII для получения pUASTattB-eys ^1-4 .Для мутации пятого (последнего) сайта-мишени Rumi в eys фрагмент кДНК eys размером 4 т.п.н., содержащий целевой сайт (EGF9) и фланкированный сайтами рестрикции NdeI и KpnI , амплифицировали с помощью ПЦР с использованием Phusion ДНК-полимераза (New England Biolabs). Продукт ПЦР клонировали в pSC-B с использованием набора для клонирования Strataclone blunt PCR (Agilent Technologies) для получения pSC-B-Eys-EGF9 . Сайт-направленный мутагенез выполняли с использованием комплементарных праймеров и ДНК-полимеразы Phusion для введения мутации серина в аланин.Фрагмент дикого типа размером 4 т.п.н. из pUASTattB-eys ^1-4 был заменен мутантной версией с использованием NdeI и KpnI для создания pUASTattB-eys ^1-5 . Все три конструкции были интегрированы в стыковочный узел VK31 стандартными методами [28], [29]. Правильная интеграция подтверждена ПЦР.

   Для создания трансгенов rumi дикого типа и мутантных, меченые FLAG версии rumi ^wt и rumi ⁷⁹ (G189E) ORF были вырезаны из pUAST-rumi ^wt-FLAG и pUAST-rumi ^79-FLAG [12] с использованием двойного расщепления EcoRI — KpnI и клонировали в вектор pUAST-attB [28].После проверки путем секвенирования конструкции были интегрированы в стыковочный сайт VK22 с использованием стандартных методов и проверены с помощью ПЦР [28], [29].

   Статистический анализ

   Данные представлены как среднее ± стандартная ошибка среднего. Для сравнения количества кластеров рабдомеров на омматидий выполняли ANOVA с множественными сравнениями Шеффе или Тьюки или тест t . Для сравнения размера IRS между омматидиями дикого типа и rumi при 65% PD использовали непарный t -тест.

   Вспомогательная информация

   Рисунок S1.

   rumi ⁷⁹ вряд ли будет доминантно-отрицательным аллелем. (A – C ‘) Сверхэкспрессия версий Rumi дикого типа (A, A’) или Rumi ⁷⁹ (B, B ‘; G189E), меченных FLAG, с помощью GMR-GAL4 не нарушает разделения рабдомеров. Обратите внимание на отсутствие прикрепления между рабдомерами, отмеченными фаллоидином (зеленый), и непрерывной экспрессией Eys (красный) у животных со сверхэкспрессией дикого типа и мутанта Rumi (A – B ‘), аналогично контрольным животным GMR-GAL4 / + (C, C ′).Масштабная шкала в A составляет 5 мкм и относится к A – C ‘. (D) Вестерн-блоттинг с антителом против FLAG показывает, что Rumi дикого типа и G189E Rumi сверхэкспрессируются на сопоставимых уровнях у животных GMR> rumi ^wt-FLAG и GMR> rumi ^79-FLAG .

   https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1004795.s001

   (TIF)

   Рисунок S2.

   Сайты-мишени Rumi в Crb EGF12, EGF13 и EGF15 являются O -глюкозилированными. (A) Идентификация пептида ⁶⁷¹ CYCTPGFTGVHCDSDVDECLSFPCLNGATCHNK ⁷⁰³ из Crb EGF12.Нумерация аминокислот для всех пептидов Crb основана на полипептиде Crb-PA (идентификатор FlyBase: FBpp0083987). На верхней панели показан полный спектр масс-спектрометрии материала, элюируемого при 8,1 мин. Ион, помеченный [M + 4H] ⁴⁺ , соответствует предсказанной массе для четырехзарядной формы пептида, модифицированного моносахаридом O -фукозы и моносахаридом O -глюкозы. Другие ионы происходят из материала, элюирующего совместно. CID-фрагментация четырехзарядной формы этого пептида, m / z 1048,3 (верхняя панель, [M + 4H] ⁴⁺ ), привела к спектру МС / МС, показанному на нижней панели.Наблюдаются многочисленные ионы фрагментов последовательности (стрелки), которые подтверждают идентичность пептида. Положение фрагментированного родительского иона в спектре МС / МС обозначено синим ромбом. Подчеркнутый синим цветом S представляет собой глюкозилированный серин, а подчеркнутый красным цветом T — фукозилированный треонин. (B) Идентификация пептида ⁷⁰⁴ INAYECVCQPGYEGENCEVDIDECGSNPCSNGSTCIDR ⁷⁴¹ из Crb EGF13. На верхней панели показан полный спектр масс-спектрометрии материала, элюируемого при 6,6 мин. Ион, помеченный [M + 4H] ⁴⁺ , соответствует предсказанной массе для четырехзарядной формы пептида, модифицированного моносахаридом O -фукозы и моносахаридом O -глюкозы.Другие ионы происходят из материала, элюирующего совместно. CID-фрагментация четырехзарядной формы этого пептида, m / z 1185,7 (верхняя панель, [M + 4H] ⁴⁺ ), привела к спектру МС / МС, показанному на нижней панели. Наблюдаются многочисленные ионы фрагментов последовательности (стрелки), которые подтверждают идентичность пептида. Положение фрагментированного родительского иона в спектре МС / МС обозначено синим ромбом. (C) Идентификация пептида ⁸⁰⁶ SNPCTNGAKCL ⁸¹⁶ из Crb EGF15.На верхней панели показан полный спектр масс-спектрометрии материала, элюируемого при 3,1 мин. Ион, помеченный [M + 2H] ²⁺ , соответствует расчетной массе для двухзарядной формы пептида, модифицированного моносахаридом O -глюкозы. Другие ионы происходят из материала, элюирующего совместно. CID-фрагментация двухзарядной формы этого пептида, m / z 693,1 (верхняя панель, [M + 2H] ²⁺ ), привела к спектру МС / МС, показанному на нижней панели. Наблюдаются многочисленные ионы фрагментов последовательности (стрелки), которые подтверждают идентичность пептида.Положение фрагментированного родительского иона в спектре МС / МС обозначено синим ромбом. Во всех спектрах МС / МС ионы, представляющие гликопептиды, обозначены черными линиями, модифицированными O -глюкозой (синий кружок) и O -фукозой (красный треугольник). Ионы, представляющие гликопептиды в спектрах МС, были использованы для генерации EIC на рис. 3B – D.

   https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1004795.s002

   (TIF)

   Рисунок S3.

   Сайты-мишени Rumi в Crb EGF16 и EGF17 являются O -глюкозилированными.(A) Идентификация пептида ⁸³¹ KGKNCEQDINECESNPCQY ⁸⁴⁹ из Crb EGF16. На верхней панели показан полный спектр масс-спектрометрии материала, элюируемого через 4 мин. Ион, помеченный [M + 3H] ³⁺ , соответствует расчетной массе для трехзарядной формы пептида, модифицированного моносахаридом O -глюкозы. Другие ионы происходят из материала, элюирующего совместно. CID-фрагментация трехзарядной формы этого пептида, m / z 846,2 (верхняя панель, [M + 3H] ³⁺ ), привела к спектру МС / МС, показанному на нижней панели.Наблюдаются многочисленные ионы фрагментов последовательности (стрелки), которые подтверждают идентичность пептида. Ионы, выбранные для фрагментации в спектре МС, обозначены красными ромбами. Положение фрагментированного родительского иона в спектре МС / МС обозначено синим ромбом. Подчеркнутый синим цветом S представляет собой глюкозилированный серин. (B) Идентификация пептида ⁸⁹⁸ NCEININECDSNPCSK ⁹¹³ из Crb EGF17. На верхней панели показан полный спектр масс-спектрометрии материала, элюируемого при 4,6 мин. Ион, обозначенный [M + 3H] ³⁺ , соответствует прогнозируемой массе для трехзарядной формы пептида, модифицированного моносахаридом O -глюкозы, а ион, обозначенный [M + 2H] 2 ⁺ , соответствует прогнозируемой массе для двухзарядная форма того же пептида.Другие ионы происходят из материала, элюирующего совместно. CID-фрагментация двухзарядной формы этого пептида, m / z 1059,1 (верхняя панель, [M + 2H] ²⁺ ), привела к спектру МС / МС, показанному на средней панели. CID-фрагментация трехзарядной формы этого пептида, m / z 706,4 (верхняя панель, [M + 3H] ³⁺ ), привела к спектру МС / МС, показанному на нижней панели. Наблюдаются многочисленные ионы фрагментов последовательности (стрелки), которые подтверждают идентичность пептида. Ионы, выбранные для фрагментации в спектре МС, обозначены красными ромбами.Позиции родительских ионов, фрагментированные в спектре МС / МС, обозначены голубыми ромбами. Во всех спектрах МС / МС ионы, представляющие гликопептиды, обозначены черными линиями, модифицированными O -глюкозой (синий кружок). Ионы, представляющие гликопептиды в спектрах МС, были использованы для генерации EIC на фиг. 3E и 3F.

   https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1004795.s003

   (TIF)

   Рисунок S4.

   Сайты-мишени Rumi в Eys EGF1, EGF2 и EGF5 являются O -глюкозилированными.(A – C) Вверху: полные МС-спектры пептидов Eys EGF1 (A), EGF2 (B) и EGF5 (C). Внизу: CID-фрагментация двухзарядной (A и B) или трехзарядной (C) форм идентифицированного пептида. Подчеркнутый синим цветом S представляет собой глюкозилированный серин, а подчеркнутый красным цветом T — фукозилированный треонин. (A) Идентификация пептида ¹⁴⁷ ACLSNPCVF ¹⁵⁵ из Eys EGF1. Нумерация аминокислот для всех пептидов Eys основана на полипептиде Eys-PE (идентификатор FlyBase: FBpp0311004). На верхней панели показан полный спектр МС материала, элюируемого при 6.3 мин. Ионы, помеченные [M + 2H] ²⁺ , соответствуют прогнозируемой массе для двухзарядных форм немодифицированного пептида (m / z 534,3) и пептида, модифицированного O -глюкозой и ксилозой (m / z 680,8). . Другие ионы происходят из материала, элюирующего совместно. CID-фрагментация двухзарядной формы немодифицированного пептида, m / z 534,3 (верхняя панель, [M + 2H] ²⁺ слева), привела к спектру МС / МС, показанному на средней панели. CID-фрагментация двухзарядной формы гликозилированного пептида, m / z 680.8 (верхняя панель, [M + 2H] ²⁺ справа), в результате спектр МС / МС показан на нижней панели. Наблюдаются многочисленные ионы фрагментов последовательности (стрелки), которые подтверждают идентичность пептидов. (B) Идентификация пептида ¹⁸⁸ SSPCQNGGTCVDGVAYY ²⁰⁴ из Eys EGF2. На верхней панели показан полный спектр масс-спектрометрии материала, элюируемого при 6,8 мин. Ион, помеченный [M + 2H] ²⁺ , соответствует предсказанной массе для двухзарядной формы пептида, модифицированного O -глюкозным моносахаридом и O -фукозным моносахаридом.Другие ионы происходят из материала, элюирующего совместно. CID-фрагментация двухзарядной формы этого пептида, m / z 1073,3 (верхняя панель, [M + 2H] ²⁺ ), привела к спектру МС / МС, показанному на нижней панели. Наблюдаются многочисленные ионы фрагментов последовательности (стрелки), которые подтверждают идентичность пептида. (C) Идентификация пептида ²⁸² HGRICQEEINECASSPCQNGGVCVDKLAAY ³²² из Eys EGF5. На верхней панели показан полный спектр масс-спектрометрии материала, элюируемого через 7,2 мин. Ион, помеченный [M + 3H] ³⁺ , соответствует расчетной массе для трехзарядной формы пептида, модифицированного моносахаридом O -глюкозы.Другие ионы происходят из материала, элюирующего совместно. CID-фрагментация трехзарядной формы этого пептида, m / z 1196,7 (верхняя панель, [M + 3H] ³⁺ ), привела к спектру МС / МС, показанному на нижней панели. Наблюдаются многочисленные ионы фрагментов последовательности (стрелки), которые подтверждают идентичность пептида. Ионы, выбранные для фрагментации в спектре МС, обозначены красными ромбами. Положение фрагментированного родительского иона в спектре МС / МС обозначено синим ромбом. Во всех спектрах МС / МС ионы, представляющие гликопептиды, обозначены черными линиями, модифицированными O -глюкозой (синий кружок) и O -фукозой (красный треугольник).Ионы, представляющие гликопептиды в спектрах МС, показанных здесь, были использованы для генерации EIC на рисунках 4B, 4C и 4D.

   https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1004795.s004

   (TIF)

   Благодарности

   Благодарим Y. Li за техническую помощь; Фондовый центр Bloomington Drosophila , Банк гибридом исследований развития, покойный Дж. Сиссон, А. Бергманн, Х. Беллен, Г. Гальдер, К. Ирвин, А. Зельхоф, С. Нам, Р. Манн, Д. Готов и особенно У.Тепасс для реагентов; К. Венкатачаламу за комментарии к рукописи; З. Мао за помощь в количественной оценке изображений; С. Чжан за помощь на начальных этапах проекта; D. Townley, M. Mancini, J. Broughman, C. Haueter, L. Duraine и H. Bellen за предоставление доступа к микроскопам TEM и / или за обучение A.R.H. пробоподготовке и электронной микроскопии.

   Вклад авторов

   Задумал и спроектировал эксперименты: ARH TVL BMH JL RSH HJN. Проведены эксперименты: АРХ ТВЛ БМХ JL YJC.Проанализированы данные: АРХ ТВЛ БМХ JL RSH HJN. Предоставленные реагенты / материалы / инструменты для анализа: BMH YJC YH RSH. Написал статью: ARH TVL BMH JL YJC YH RSH HJN.

   Ссылки

   1. 1. Borst A (2009) Взгляд дрозофил на зрение насекомых. Curr Biol 19: R36–47.
   2. 2. Nilsson DE (1990) От роговицы к изображению сетчатки в глазах беспозвоночных. Trends Neurosci 13: 55–64.
   3. 3. Clandinin TR, Zipursky SL (2000) Взаимодействия афферентных конусов роста контролируют синаптическую специфичность в зрительной системе Drosophila.Нейрон 28: 427–436.
   4. 4. Киршфельд К. (1967) [Проекция оптического окружения на экране рабдомера в сложном глазу Маски] (оригинал на немецком языке). Exp Brain Res 3: 248–270.
   5. 5. Husain N, Pellikka M, Hong H, Klimentova T, Choe KM, et al. (2006) Закрытие глаз, связанных с агрином / перлеканом, важно для образования эпителиального просвета в сетчатке дрозофилы. Dev Cell 11: 483–493.
   6. 6. Zelhof AC, Hardy RW, Becker A, Zuker CS (2006) Преобразование архитектуры сложных глаз.Nature 443: 696–699.
   7. 7. Коэльо Д.С., Кайррао Ф., Зенг Х, Пирес Э., Коэльо А.В. и др. (2013) Xbp1-независимая передача сигналов Ire1 необходима для дифференцировки фоторецепторов и морфогенеза рабдомеров у Drosophila. Cell Rep 5: 791–801.
   8. 8. Gurudev N, Yuan M, Knust E (2014) хаоптин, проминин, закрытые глаза и крошки образуют генетическую сеть, контролирующую апикальный компартмент фоторецепторных клеток дрозофилы. Biol Open 3: 332–341.
   9. 9. Nie J, Mahato S, Mustill W., Tipping C, Bhattacharya SS, et al.(2012) Межвидовой анализ Проминина показывает консервативную клеточную роль в фоторецепторных клетках беспозвоночных и позвоночных. Дев Биол 371: 312–320.
   10. 10. Tepass U, Theres C, Knust E (1990) crumbs кодирует EGF-подобный белок, экспрессируемый на апикальных мембранах эпителиальных клеток дрозофилы и необходимый для организации эпителия. Ячейка 61: 787–799.
   11. 11. Pellikka M, Tanentzapf G, Pinto M, Smith C, McGlade CJ и др. (2002) Crumbs, у дрозофилы гомолог человеческого CRB1 / RP12, важен для морфогенеза фоторецепторов.Природа 416: 143–149.
   12. 12. Акар М., Джафар-Неджад Х., Такеучи Х., Раджан А., Ибрани Д. и др. (2008) Rumi представляет собой гликозилтрансферазу домена CAP10, которая модифицирует Notch и необходима для передачи сигналов Notch. Ячейка 132: 247–258.
   13. 13. Рана Н.А., Нита-Лазар А., Такеучи Х., Какуда С., Лютер К. Б. и др. (2011) Трисахарид O-глюкозы присутствует с высокой, но переменной стехиометрией во многих сайтах Notch2 мыши. J Biol Chem 286: 31623–31637.
   14. 14. Леонарди Дж., Фернандес-Вальдивия Р., Ли Ю. Д., Симкокс А. А., Джафар-Нежад Х (2011). Множественные сайты O-глюкозилирования на Notch функционируют как буфер против зависящей от температуры потери передачи сигналов.Разработка 138: 3569–3578.
   15. 15. Perdigoto CN, Schweisguth F, Bardin AJ (2011) Определенные уровни активности Notch для приверженности и терминальной дифференцировки стволовых клеток в кишечнике взрослой мухи. Разработка 138: 4585–4595.
   16. 16. Фернандес-Вальдивия Р., Такеучи Х., Самарганди А., Лопес М., Леонарди Дж. И др. (2011) Регулирование передачи сигналов Notch и эмбрионального развития млекопитающих с помощью протеина O-глюкозилтрансферазы Rumi. Разработка 138: 1925–1934.
   17. 17. Такеучи Х., Фернандес-Вальдивия Р.С., Касвелл Д.С., Нита-Лазар А., Рана Н.А. и др. (2011) Руми действует как протеин-O-глюкозилтрансфераза и протеин-O-ксилозилтрансфераза. Proc Natl Acad Sci U S A 108: 16600–16605.
   18. 18. Ли ТВ, Сетхи М.К., Леонарди Л., Рана Н.А., Бюттнер Ф.Ф. и др. (2013) Отрицательная регуляция передачи сигналов Notch ксилозой. PLoS Genet 9: e1003547.
   19. 19. Longley RL Jr, Ready DF (1995) Интегрины и развитие трехмерной структуры сложного глаза дрозофилы.Дев Биол 171: 415–433.
   20. 20. Izaddoost S, Nam SC, Bhat MA, Bellen HJ, Choi KW (2002) Drosophila Crumbs — это позиционный сигнал в соединениях и рабдомерах фоторецепторов. Природа 416: 178–183.
   21. 21. Johnson K, Grawe F, Grzeschik N, Knust E (2002) Drosophila crumbs необходимы для подавления индуцированной светом дегенерации фоторецепторов. Curr Biol 12: 1675–1680.
   22. 22. Chen CL, Gajewski KM, Hamaratoglu F, Bossuyt W., Sansores-Garcia L, et al.(2010) Детерминант апикально-базальной клеточной полярности Crumbs регулирует передачу сигналов Hippo у Drosophila. Proc Natl Acad Sci U S A 107: 15810–15815.
   23. 23. Лин Ц, Чжэн И, Инь Ф, Ю Дж, Хуанг Дж и др. (2010) Апикальный трансмембранный белок Crumbs функционирует как опухолевый супрессор, который регулирует передачу сигналов Hippo путем связывания с Expanded. Proc Natl Acad Sci U S A 107: 10532–10537.
   24. 24. Richardson EC, Pichaud F (2010) Crumbs необходим для достижения надлежащего контроля размера органов во время развития головы дрозофилы.Развитие 137: 641–650.
   25. 25. Хуанг Дж., Чжоу В., Донг В., Ватсон А.М., Хун И. (2009) С обложки: Направленные, эффективные и универсальные модификации генома дрозофилы с помощью геномной инженерии. Proc Natl Acad Sci U S A 106: 8284–8289.
   26. 26. Robinson BS, Huang J, Hong Y, Moberg KH (2010) Crumbs регулирует передачу сигналов Salvador / Warts / Hippo у дрозофилы через расширенный белок FERM-домена. Curr Biol 20: 582–590.
   27. 27. Ryoo HD, Domingos PM, Kang MJ, Steller H (2007) Ответ развернутого белка в модели дегенерации сетчатки у дрозофилы.Embo J 26: 242–252.
   28. 28. Бишоф Дж., Маеда Р.К., Хедигер М., Карч Ф., Баслер К. (2007) Оптимизированная система трансгенеза для дрозофилы с использованием интегразы phiC31, специфичной для зародышевой линии. Proc Natl Acad Sci U S A 104: 3312–3317.
   29. 29. Venken KJ, He Y, Hoskins RA, Bellen HJ (2006) P [acman]: трансгенная платформа ВАС для направленной вставки больших фрагментов ДНК в D. melanogaster. Наука 314: 1747–1751.
   30. 30. Молони DJ, Шаир Л.Х., Лу Ф.М., Ся Дж., Лок Р. и др.(2000) Notch2 млекопитающих модифицирован двумя необычными формами О-связанного гликозилирования, обнаруженного на модулях, подобных эпидермальному фактору роста. J Biol Chem 275: 9604–9611.
   31. 31. Takeuchi H, Kantharia J, Sethi MK, Bakker H, Haltiwanger RS ​​(2012) Сайт-специфическое O-глюкозилирование эпидермального фактора роста (EGF) повторов notch: эффективность гликозилирования зависит от правильной укладки и аминокислотной последовательности отдельные повторы EGF. J Biol Chem 287: 33934–33944.
   32. 32.Wodarz A, Hinz U, Engelbert M, Knust E (1995) Экспрессия crumbs придает апикальный характер доменам плазматической мембраны эктодермального эпителия Drosophila. Cell 82: 67–76.
   33. 33. Roper K (2012) Анизотропия Crumbs и aPKC управляет сборкой миозинового кабеля во время образования трубки. Клетка развития 23: 939–953.
   34. 34. Абд Эль-Азиз М.М., Барраган I, О’Дрисколл, Калифорния, Гудштадт Л., Пригмор Э. и др. (2008) EYS, кодирующий ортолог Drosophila spacemaker, мутирован при аутосомно-рецессивном пигментном ретините.Нат Генет 40: 1285–1287.
   35. 35. Коллин Р.В., Литтинк К.В., Клеверинг Б.Дж., ван ден Борн Л.И., Коенекоп Р.К. и др. (2008) Идентификация человеческого ортолога Drosophila eyes shut / spacemaker размером 2 Mb, который мутирован у пациентов с пигментным ретинитом. Am J Hum Genet 83: 594–603.
   36. 36. Iwanami M, Oshikawa M, Nishida T, Nakadomari S, Kato S (2012) Высокая распространенность мутаций в гене EYS у японских пациентов с аутосомно-рецессивным пигментным ретинитом. Инвестируйте в офтальмол Vis Sci 53: 1033–1040.
   37. 37. Литтинк К.В., ван ден Борн Л.И., Коенекооп Р.К., Коллин Р.В., Зонневельд М.Н. и др. (2010) Мутации в гене EYS составляют примерно 5% аутосомно-рецессивного пигментного ретинита и вызывают довольно однородный фенотип. Офтальмология 117: 2026–2027, 2026-2033, 2033, e2021-2027.
   38. 38. Audo I, Sahel JA, Mohand-Said S, Lancelot ME, Antonio A и др. (2010) EYS является основным геном дистрофии палочки-шишки во Франции. Хум Мутат 31: E1406–1435.
   39. 39.Катагири С., Акахори М., Хаяси Т., Ёситаке К., Гекка Т. и др. (2014) Аутосомно-рецессивная дистрофия конического стержня, связанная с составными гетерозиготными мутациями в гене EYS. Док офтальмол 128: 211–217.
   40. 40. Прас Э., Абу А., Ротенштрайх Й., Авни И., Рейш О. и др. (2009) Дистрофия шишковидного стержня и мутация сдвига рамки считывания в гене PROM1. Мол Виса 15: 1709–1716.
   41. 41. Чжан К., Зульфикар Ф., Сяо Х, Риазуддин С.А., Ахмад З. и др. (2007) Тяжелый пигментный ретинит, картированный в 4p15 и связанный с новой мутацией в гене PROM1.Hum Genet 122: 293–299.
   42. 42. Березкин А., Зелингер Л., Банда-Розенфельд Д., Шевач Е., Харель А. и др. (2014) Идентификация мутаций, вызывающих наследственные дегенерации сетчатки в израильском и палестинском населении, с использованием картирования гомозиготности. Инвестируйте в офтальмол Vis Sci 55: 1149–1160.
   43. 43. Перманьер Дж., Наварро Р., Фридман Дж., Помарес Э., Кастро-Наварро Дж. И др. (2010) Аутосомно-рецессивный пигментный ретинит с ранним поражением желтого пятна, вызванным преждевременным усечением PROM1.Инвестируйте в офтальмол Vis Sci 51: 2656–2663.
   44. 44. Xu D, Wang Y, Willecke R, Chen Z, Ding T и др. (2006) Эффекторные каспазы drICE и dcp-1 имеют частично перекрывающиеся функции в пути апоптоза у Drosophila. Смерть и дифференциация клеток 13: 1697–1706.
   45. 45. Okajima T, Xu A, Irvine KD (2003) Модуляция связывания notch-лиганда с помощью протеина O-фукозилтрансферазы 1 и бахромы. J Biol Chem 278: 42340–42345.
   46. 46. Сюй А., Хейнс Н., Длугош М., Рана Н.А., Такеучи Х. и др.(2007) Восстановление in vitro модуляции связывания Notch-лиганда дрозофилы с помощью Fringe. J Biol Chem 282: 35153–35162.
   47. 47. Nita-Lazar A, Haltiwanger RS ​​(2006) Методы анализа O-связанных модификаций на повторах, подобных эпидермальному фактору роста, и тромбоспондину типа 1. Методы Enzymol 417: 93–111.
   48. 48. Culi J, Mann RS (2003) Boca, белок эндоплазматического ретикулума, необходимый для бескрылой передачи сигналов и транспортировки членов семейства рецепторов LDL у Drosophila.Ячейка 112: 343–354.
   49. 49. Sisson JC, Field C, Ventura R, Royou A, Sullivan W. (2000) Лавовая лампа, новый периферический белок гольджи, необходим для клеточной клеточной обработки Drosophila melanogaster. J Cell Biol 151: 905–918.
   50. 50. Satoh AK, O’Tousa JE, Ozaki K, Ready DF (2005) Rab11 опосредует перенос родопсина после Гольджи на светочувствительную апикальную мембрану фоторецепторов дрозофилы. Развитие 132: 1487–1497.
   51. 51. Chinchore Y, Mitra A, Dolph PJ (2009) Накопление родопсина в поздних эндосомах запускает дегенерацию фоторецепторных клеток.PLoS Genet 5: e1000377.
   52. 52. Nolo R, Abbott LA, Bellen HJ (2000) Senseless, фактор транскрипции пальца цинка, необходим и достаточен для развития сенсорных органов у дрозофилы. Ячейка 102: 349–362.
   53. 53. Fabian-Fine R, Verstreken P, Hiesinger PR, Horne JA, Kostyleva R, et al. (2003) Эндофилин способствует поздней стадии эндоцитоза в глиальных инвагинациях в окончаниях фоторецепторов дрозофилы. J Neurosci 23: 10732–10744.
   54. 54. Сигал М.Л., Хартл Д.Л. (1996) Замена трансгена и высокоэффективная сайт-специфическая рекомбинация с системой Cre / loxP у дрозофилы.Генетика 144: 715–726.
   55. 55. Хигучи Р., Краммель Б., Сайки Р.К. (1988) Общий метод подготовки in vitro и специфический мутагенез фрагментов ДНК: изучение взаимодействий белков и ДНК. Nucleic Acids Res 16: 7351–7367.
   .